血管内皮生长因子在实验性脉络膜新生血管生成中表达的时相变化

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管(CNV)生成中表达的时相变化。方法:应用532nm倍频激光对30只有色大鼠的实验眼进行视网膜光凝,建立CNV模型,分别于光凝后3d;1,2,3和4wk行荧光素眼底血管造影(FFA)后处死大鼠,摘除眼球,制作组织病理学标本,原位杂交法检测VEGFmRNA表达,免疫组织化学法和免疫荧光染色法检测VEGF蛋白的表达。结果:正常大鼠视网膜神经节细胞层、内核层、色素上皮层、视网膜及脉络膜血管内皮细胞中均有VEGFmRNA和蛋白表达。光凝后3d,Ⅷ因子阳性的内皮细胞由破裂的Bruch膜长入视网膜下,但尚未形成CNV;光凝后7d,Ⅷ因子阳性的内皮细胞围成的血管样结构,FFA检查可见相应区域有圆盘状荧光素渗漏,表明CNV生成。同时发现,光凝后3d,在光凝区外核层缺损处,增生和移行的色素上皮细胞、色素性巨噬细胞、成纤维细胞和增生的内皮细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达呈强阳性;CNV中VEGFmRNA和蛋白在1wk时表达最强(P<0.01),2wk后其表达迅速下降。结论:VEGF的表达早于CNV的生成,提示其潜在的重要作用。     

血管生成素-2及其受体在脉络膜新生血管中的表达

目的研究血管生成素2(Ang2)及其受体Tie2在脉络膜新生血管(CNV)中的作用机制。方法应用氪激光诱导BN大鼠CNV,检测Ang2mRNA,Ang2和Tie2在CNV中的表达,探讨其作用。结果Ang2mRNA在正常BN大鼠视网膜无表达。光凝后7d,Ang2mRNA于视网膜神经节细胞层、内核层、外核层缺损区、视网膜和脉络膜血管内皮细胞的阳性染色密度最高(P<0.05),7d后变化差异不显著(P>0.05)。Ang2及受体与Ang2mRNA表达部位及趋势相同。Tie2在正常脉络膜血管内皮细胞表达。结论Ang2和Tie2结合,参与CNV形成。     

VEGF-B及其受体Flt-1在氪激光诱导的大鼠脉络膜新生血管中的表达

目的　研究血管内皮生长因子 B(vascularendothelialgrowthfactor B ,VEGF-B)及其受体Flt-1(fms liketyrosinekinase 1,Flt-1)在氪激光诱导的棕色挪威(BrownNorway ,BN)大鼠脉络膜新生血管(choroidalneovascularization ,CNV)形成中的作用机制。方法　应用氪激光(6 4.7nm ,36 0mW ,5 0 μm ,0 .0 5s)对实验组15只BN大鼠双眼进行眼底光凝。对照组15只大鼠只散瞳不光凝。2组分别于光凝后7d、14d、2 8d、5 6d、84d行眼底荧光血管造影(fundusfluoresceinangiography ,FFA) ,然后摘除眼球制作标本进行免疫组织化学检测VEGF-B和Flt-1,原位杂交检测VEGF BmRNA。结果　VEGF BmRNA在正常BN大鼠视网膜神经节细胞层、内核层、色素上皮层、视网膜和脉络膜血管内皮细胞表达。实验眼光凝后7d ,在激光损伤区VEGF BmRNA表达于视网膜神经节细胞层、内核层、外核层缺损区、视网膜和脉络膜血管内皮细胞及CNV增殖区,14d时CNV增殖区VEGF BmRNA阳性细胞染色密度最高(P <0 .0 1) ,1月后变化差异不显著(P >0 .1)。VEGF-B蛋白质与VEGF BmRNA的表达部位及趋势相同。Flt-1在正常视网膜色素上皮细胞、外界膜及外丛状层有阳性表达,视细胞层内侧及外核层有轻度着染。实验眼光凝7d后,Flt-1在神经节细胞层、内核层、外核层缺损区及CNV增     

脉络膜新生血管动物模型的建立与评估

目的:评价氪激光诱导棕色挪威(brown norway,BN)大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型的可行性。方法:BN大鼠32只一眼行氪激光(659nm)眼底光凝,另一眼作空白对照。激光功率、光凝斑直径和曝光时间分别为360mW、50μm及0.05s。分别在光凝后7,14,21,28d随机选取7只大鼠行眼底照像、荧光素眼底血管造影(FFA)检查。随机选取1只大鼠行脉络膜血管铺片检查。眼球标本行组织病理切片光镜、免疫组织化学染色观察。结果:光凝后7d,CNV开始形成,21d达到高峰,14~28dCNV无明显变化。7~21d,FFA显示造影晚期荧光素渗漏及光镜下CNV厚度逐渐增加,28d时可能因瘢痕开始形成,故FFA渗漏和CNV厚度开始减少。结论:氪激光诱导BN大鼠的CNV模型是一种较为理想的模型,FFA及CNV厚度分析是CNV定量研究的有效手段。     

诱导型一氧化氮合酶在大鼠脉络膜新生血管中的表达及其与血管生成的关系

目的探讨氪激光诱导大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)形成中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor,VEGF)的表达及其与CNV形成的关系。方法对5组30只BN大鼠行单眼视网膜氪激光光凝,诱导脉络膜新生血管形成。分别在光凝后3d、1周、2周、3周、4周摘除眼球,应用免疫组织化学技术对光凝区进行Ⅷ因子相关抗原(factorⅧrelated antigen,FⅧR:Ag)检测以观测CNV形成,并检测CNV形成过程中i NOS、VEGF蛋白的表达,半定量分析i NOS、VEGF表达变化与CNV生成的相关性。结果FⅧR:Ag免疫组织化学检查结果显示,光凝后1周开始形成CNV,3~4周达到高峰。正常BN大鼠视网膜中,i NOS在神经节细胞、内核层表达;VEGF在视网膜神经节细胞层、内核层、色素上皮层、视网膜和脉络膜血管内皮细胞均有表达。视网膜光凝后,除上述部位外,i NOS和VEGF均在外核层和脉络膜的光凝损伤区阳性表达。光凝后3d~4周,光斑区内FⅧR:Ag、i NOS和VEGF阳性染色密度逐渐增加(P<0.05);i NOS、VEGF与FⅧR:Ag阳性染色密度正相关(r=0.89,r=0.78,P<0.05);i NOS与VEGF阳性染色密度正相关(r=0.78,P<0.05)。结论i NOS与VEGF同步表达,其阳性表达密度与CNV生成正相关,i NOS在CNV生成中可能起着重要的作用。     

色素上皮衍生因子在大鼠脉络膜新生血管中的表达及意义

目的　探讨激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管 (choroidalneovascularization ,CNV)中色素上皮衍生因子 (pigmentepithelium derivedfactor,PEDF)的表达及意义。方法　对 5组 30只BN大鼠行单眼视网膜氪激光光凝 ,诱导脉络膜新生血管形成。分别在光凝后 3d ,1、2、3及 4周摘除眼球 ,对光凝区进行病理学检查、Ⅷ因子相关抗原 (FⅧR :Ag)的免疫组织化学检查 ,以观测CNV形成。应用免疫组织化学及原位杂交技术检测CNV形成过程中PEDF、PEDFmRNA的表达及变化。结果　病理学检查及FⅧR :Ag免疫组织化学检查显示 ,光凝后 1周开始形成CNV ,3～ 4周达到高峰。正常BN大鼠PEDFmRNA、PEDF在视网膜神经节细胞、内核层部分细胞、视网膜色素上皮层表达。视网膜光凝后 ,PEDFmRNA、PEDF阳性染色信号可见于视网膜神经节细胞层、内核层、视网膜色素上皮层、外核层和脉络膜的损伤区 ;光斑边缘近脉络膜侧PEDF阳性表达信号明显高于光斑内部。光凝后 3d至 4周 ,光斑区内FⅧR :Ag阳性染色密度逐渐增加 (P <0 0 5 ) ,PEDFmRNA、PEDF阳性染色密度逐渐下降 (P<0 0 5 ) ,PEDF与FⅧR :Ag阳性染色密度负相关 (r=- 0 84 ,P <0 0 5 )。结论　CNV形成与PEDF表达量负相关 ,提示PEDF表达不足可能是CNV形成和增生的主要原因之一。     

氪激光诱导的大鼠脉络膜新生血管模型研究

目的 探讨氪激光创建棕色挪威(brown norway,BN)大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型的可行性,为明确CNV的发生机制及防治研究奠定基础。方法 雄性BN大鼠33只(66只眼),取每只鼠一只眼作为实验眼,另一只眼为对照眼。用氪激光(波长为647nm)对大鼠实验眼视网膜进行光凝,激光功率、光凝斑直径和曝光时间分别为360mW、50μm及0．05s,每只眼10个光凝斑点。于光凝后3、7、14、21、28及56d行荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和吲哚青绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)检查后处死动物,摘除眼球制作标本,进行组织病理学及电镜观察。结果 光凝后7d出现CNV,21d达高峰,造模成功率为76．0％,FFA检查显示典型圆盘状荧光渗漏,ICGA检查可见CNV充盈,光镜和电镜下均可见视网膜下CNV形成。CNV厚度自光凝后7—21d逐渐增加,之后CNV厚度变化不显著。结论 氪激光损伤可以创建BN大鼠脉络膜新生血管模型,成模时间短,持续时间长,成模率高。     

CD105评价脉络膜新生血管变化的实验研究

目的:通过免疫组织化学法观察CD105对实验性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)变化评价的准确性.方法:采用氪激光诱导棕色挪威(brown Norway,BN)大鼠建立实验性CNV模型.24只雄性BN大鼠,随机分为正常对照组(6只)与模型组(18只).模型组行659nm氪激光视网膜光凝,功率360mW,曝光时间0.05s,光斑直径50μm.光凝后7、14、21d行荧光素钠和吲哚菁绿眼底血管造影,观察CNV形成率及渗漏光斑平均光密度值(average optical density,AOD)变化.处死大鼠,获得眼球标本,观察CNV的组织病理学变化和CD105因子的表达.结果:光凝后7d,CNV开始形成,14d和21d达到高峰.光凝后7、14、21d的CNV形成率分别为77.08%、85.42%、89.58%.光凝后7~21d,荧光素渗漏AOD值逐渐增高(P<0.05),7d与14d比较差异有统计学意义(P<0.05),14d与21d比较差异无统计学意义(P>0.05).造模后7~21d,CD105因子表达先升高后下降,7d与14d比较AOD值差异有统计学变化(P<0.05),14d与21d比较AOD值差异无统计学变化(P>0.05).结论:CD105免疫组织化学与眼底血管造影对CNV变化规律的研究结果具有高度一致性,CD105免疫组织化学评价CNV具有准确、易操作的优点.     

碱性成纤维细胞生长因子及其受体FGFR1在脉络膜新生血管中的表达

目的　研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)及其受体FGFR1在氪激光诱导的棕色挪威 (BN)大鼠脉络膜新生血管 (CNV)形成中的作用机制。方法　应用氪激光 ( 64 7nm ,3 60mW ,5 0 μm ,0 .0 5s)对 3 0只雄性BN大鼠实验眼进行视网膜光凝 ,分别于光凝后 3、7、14、2 1、2 8和 5 6d摘除眼球进行原位杂交检测bFGFmRNA ,免疫组织化学检测bFGF和FGFR1。结果　光凝 3d后 ,光凝区视网膜内bFGFmRNA和FGFR1蛋白表达水平逐渐下降 (P <0 .0 1)。 7d后视网膜下出现bFGFmRNA和FGFR1染色阳性的CNV ,此后其阳性染色面积及密度逐渐增加 (P <0 .0 1)。结论　bFGF和FGFR1通过自分泌和旁分泌途径在新生血管形成部位结合 ,引起FGFR1自磷酸化 ,诱导血管内皮细胞分化和CNV形成     

康柏西普对实验性脉络膜新生血管的作用机制研究

目的　探究康柏西普对实验性脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的作用机制。方法　选取40只7周龄的雄性BN大鼠，采用多波长氪激光对豚鼠左眼行视网膜光凝，制作CNV大鼠模型，并随机分为4组，空白对照组、模型组、低剂量康柏西普组和高剂量康柏西普组；于造模后7 d、14 d注射康柏西普，并在造模后21 d进行右眼眼底彩照、眼底荧光素血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）检查，检测CNV 发生率及渗漏面积，使用FITC灌注脉络膜铺片测量CNV面积，使用HE染色观察大鼠视网膜结构，使用Western blot检测大鼠视网膜中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸激酶 （serine/threonine kinase，AKT）表达情况。结果　除吲哚菁绿血管造影荧光点数、CNV发生率外，相比空白对照组，模型组大鼠CNV渗透面积，荧光素渗漏面积，脉络膜结构损伤程度，视网膜中 HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表达均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；相比模型组，康柏西普组大鼠上述各指标显著降低，高剂量康柏西普组上述各指标显著低于低剂量康柏西普组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　康柏西普可以抑制脉络膜视网膜中 HIF-1α、AKT和VEGF蛋白的表达，从而抑制由氪激光光凝眼底而产生的实验性CNV生长。     

Expression of cell adhesion molecules and vascular endothelial growth factor in experimental choroidal neovascularisation in the rat

AIMS—To investigate the longevity and reproducibility of choroidal neovascularisation (CNV) induced by krypton laser photocoagulation in the rat. The presence of cell adhesion molecules (CAMs) and vascular endothelial growth factor (VEGF) during the development of CNV was also studied.
METHODS—67 pigmented rats underwent retinal photocoagulation by krypton laser. The eyes were examined by either single or serial fluorescein angiography at 3 days, 1, 2-3, 4-5, 7-8, and 12 weeks post photocoagulation. The expression of CAMs (ICAM-1, E-selectin, and CD44) and VEGF post photocoagulation was studied by immunohistochemistry.
RESULTS—CNV related fluorescein leakage appeared in 46.4% of 766 laser spots delivered to the 58 eyes that were tested at 2-3 weeks post treatment. The ratio of hyperfluorescent laser sites did not change significantly at 8 weeks post laser. The number of leaky spots was independent of the total number of lesions delivered to each eye (at 2-3 weeks post laser 10-15 spots/eye: 44% and 25-30 spots/eye: 49%; t=0.7673; p=0.3903). Nine eyes were followed by serial angiography between 2 and 12 weeks. The laser spots with fluorescein leakage at 2 weeks (51.5%) remained leaky at 12 weeks (51.5%). Histopathologically, macrophage accumulation peaked at 5 days and CNV was firstly observed at 1 week post photocoagulation. ICAM-1, E-selectin, CD44, and VEGF were maximally induced at 3-5 days post laser photocoagulation, and were localised to RPE, choroidal vascular endothelial, and inflammatory cells. VEGF was also detected in intravascular leucocytes at the sites of laser lesions.
CONCLUSIONS—These studies demonstrated that krypton laser photocoagulation can be successfully used to produce lesions similar to those of human CNV. The response induced remained present for an extended period of time (12 weeks), thus offering a potential model to screen candidate CNV inhibitory agents. In addition, it is proposed that the expression of ICAM-1, E-selectin, CD44, and VEGF before new vessel formation might be linked to the initiation of CNV.

Keywords: choroidal neovascularisation; cell adhesion molecules; vascular endothelial growth factor     

Differences in the temporal expression of regulatory growth factors during choroidal neovascular development

Although the roles of vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and hepatocyte growth factor (HGF) in pathologic neovascularization have been well characterized in certain tissues, their particular functions and expression patterns in choroidal neovascularization (CNV) have not been clearly established. After localized laser trauma to Bruch's membrane to induce CNV development, the temporal changes in mRNA and protein expression of these 3 cytokines were documented and compared histologically to areas of immunofluorescence, the proliferation of endothelial cells, neovascular development, and temporal changes in vascular permeability. Changes in mRNA and protein levels of bFGF and HGF occurred quickly and reached peak expression within hours. This activity corresponded in time to intense and localized immunofluorescence for these cytokines within the choriocapillaris within laser lesion sites. During this same initial time period, mRNA upregulation of VEGF occurred, primarily within the neural retina and this expression corresponded to intense immunolabeling of Müller cells immediately adjacent to the lesion sites. By 3 days after lasering, increased VEGF₁₆₄ protein expression was measurable, whereas early neovascular development histologically corresponded to HGF and bFGF mRNA expansion into the developing choroidal neovascular membrane (CNVM). At 7 days, CNV expansion, maturation, and increased vascular permeability corresponded to peak VEGF mRNA and protein expression and to immunofluorescence of the CNVM. Differences also occurred in the expression of precursor and activated isoforms of these cytokines in the retinal pigment epithelium/choroid as compared to those in the retina. These molecular and immunocytochemical results suggest that bFGF and HGF may be important as initial regulators neovascularization in this CNV model; whereas VEGF may be important during later phases of angiogenesis and neovascular hyperpermeability.     

实验性脉络膜新生血管中环氧合酶-2、血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-2的表达

目的研究实验性脉络膜新生血管（CNV）大鼠中环氧合酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达,并进一步探讨其在CNV中的作用机制及相互关系。方法应用氪红激光光凝视网膜的方法诱导制作BN大鼠的CNV模型,分别选取并制作无任何干预的对照组和实验组光凝后第3、7、14、21、30天的＂最大CNV膜＂切片,采用免疫组织化学技术检测COX-2、VEGF和MMP-2在视网膜和CNV膜中的表达。应用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统测定COX-2、VEGF和MMP-2阳性染色的平均灰度值。结果 COX-2、VEGF和MMP-2在正常视网膜和脉络膜中呈弱表达,视网膜光凝后,COX-2、VEGF和MMP-2在视网膜和CNV膜中的表达在7～14 d逐渐增强,21 d时三者的表达强度均达到高峰,之后略减弱。视网膜光凝后7、14、21、30 d,实验组COX-2、VEGF和MMP-2的免疫组织化学染色平均灰度值与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。COX-2的表达强度与VEGF和MMP-2的变化均呈正相关（r=0.967,P=0.007;r=0.966,P=0.007）。结论激光诱导的实验性CNV中COX-2、VEGF及MMP-2的表达随着时间的延长呈动态变化,CNV局部炎症诱导的COX-2表达可能是VEGF和MMP-2的上游调节因子。     

Correlation of CD105 and Vascular Endothelial Growth Factor in Laser-induced Choroidal Neovascularization in Rats

Introduction Angiogenesis plays a central role in the growth and development of normal tissues and in a variety of pathological settings. It is a complex multistep process involving growth and migration of endothelial cells, and capillary morphogenesis . These processes are tightly controlled by positive and negative angiogenic factors and their receptors, which regulate one or more of these key events[1-3]. Although the regulatory mechanisms of angiogenesis are not fully understood, evidence …     

CD147在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管中的表达

背景 脉络膜新生血管(CNV)是眼底多种疾病的共有病理改变,是造成中心视力严重损害的主要原因之一.基质金属蛋白酶(MMPs)诱导因子CD147能通过旁分泌作用刺激多种细胞MMPs表达,降解细胞间质和基底膜成分,具有促进血管新生作用. 目的 通过建立激光诱导的棕色挪威(BN)大鼠CNV动物模型,观察CD147和血管内皮生长因子(VEGF)在CNV形成过程中的动态表达. 方法 将30只清洁级BN大鼠按照随机数字表法分为正常对照组6只和激光光凝组24只,于光凝后1、7、14和21d通过荧光素眼底血管造影(FFA)观察CNV形成;采用Western blot法分别检测正常对照组和激光光凝后1、7、14和21 d组大鼠视网膜色素上皮(RPE)-脉络膜-巩膜复合物中CD147蛋白相对表达水平的变化;采用ELISA法检测各组大鼠玻璃体腔内VEGF质量浓度变化. 结果 FFA检查显示,激光光凝后7d开始出现盘状荧光素渗漏,激光光凝后14d形成CNV.正常对照组激光光凝前,光凝后1、7、14和21d,大鼠RPE-脉络膜-巩膜复合物中CD147蛋白的相对表达量分别为1.00±0.43、0.97±0.53、0.99±0.45、1.56±0.67和2.27±0.54,玻璃体腔内VEGF质量浓度分别为(72.96±29.95)、(79.36±10.46)、(103.82±32.94)、(166.05±21.54)和(195.64±39.90) pg/ml,总体比较差异均有统计学意义(CD147:F=10.95,P＜0.01;VEGF:F=304.50,P＜0.01);激光光凝后14 d和21 d,大鼠CD147蛋白和VEGF的相对表达量均较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 CD147在激光诱导的大鼠CNV中进行性升高,与VEGF的表达趋势一致,CD147可能参与CNV的早期形成,在眼部血管新生中发挥重要作用.     

Intravitreal triamcinolone does not alter basal vascular endothelial growth factor mRNA expression in rat retina

Intravitreal triamcinolone inhibits choroidal neovascularization. To investigate if vascular endothelial growth factor (VEGF) is affected, we examined VEGF expression after intravitreal triamcinolone administration in rat retina. Using in situ hybridization, we have found dense clustered VEGF mRNA signals in the retinal pigment epithelium, moderate patchy signals in the inner nuclear layer, and positive labeling in a sub-population of ganglion cells. Densitometry and northern blot analysis revealed no significant alteration of VEGF mRNA expression pattern and level 3-21 days after triamcinolone injection. Our data indicate that intravitreal triamcinolone does not affect basal VEGF mRNA expression in normal adult rat retina.     

PEDF和VEGF mRNA在实验性脉络膜新生血管组织中的表达

目的 研究血管内皮生长因子(vessel endothelial growth factor，VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)在实验性小鼠脉络膜新生血管(choroidal neowascularization,CNV)组织中的表达情况。探讨二者在CNV形成过程中所起的作用。方法 用半导体激光诱导小鼠CNV模型。分别于激光后1、3、7d、2和3周时取出眼球，采用原位杂交方法检测CNV组织中VEGF和PEDF mRNA的表达情况。结果 VEGF和PEDF mRNA在激光诱导的小鼠CNV组织形成过程中均有显著表达。激光光凝早期二者的表达均增高，但VEGF mRNA的表达升高更显著。激光照射后3和7d时．VEGF mRNA的表达即达到高峰，阳性率分别为26．05％和27．92％，而PEDF mRNA的阳性表达率分别为21．13％和23．55％．2周时，VEGF mRNA表达开始下降，约为23．95％，而PEDF mRNA的表达则达到高峰,为29．19％,光凝后3周时，二者的表达均下降，但PEDF mRNA的表达仍高于VEGF mRNA的表达，分别为24．87％和21．93％．结论 VEGF和PEDF mRNA明显表达于实验性小鼠CNV组织中。2者表达失衡可能在CNV的形成过程中起到调控作用。