胰岛素对人腹膜间皮细胞增殖、损伤及凋亡的影响

目的明确胰岛素是否对人腹膜间皮细胞具有毒性或者保护作用。方法使用人腹膜间皮细胞细胞株，传代培养。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定HPMC的增殖程度。采用全自动生化分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶LDH水平示细胞损伤，Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态学变化及计算凋亡细胞百分比。分为单纯培养基对照组，4．25％葡萄糖组，不同浓度胰岛素组和不同浓度的胰岛素加4．25％葡萄糖组。结果与对照组相比，4．25％葡萄糖致LDH水平明显增高，并显著降低NIT渗入量，明显增加凋亡细胞百分比；不同浓度的胰岛素对HPMC增殖无影响，不同浓度胰岛素24h后可明显升高LDH水平(P＜0．05)，不同浓度胰岛素作用12h均后导致凋亡细胞百分比显著升高(P＜0．05)；不同浓度葡萄糖胰岛素组12h、24hMMT渗入量较葡萄糖组明显升高(P＜0．05)，组间差异无显著性(P＞0．05)，浓度大于25U／L胰岛素加葡萄糖组作用24h后与葡萄糖组相比显著降低LDH水平(P＜0．05)；不同浓度胰岛素加葡萄糖组作用12h后与葡萄糖组相比凋亡细胞百分比明显下降(P＜0．05)。结论胰岛素能导致HPMC损伤、诱导凋亡，同时在一定范围内可缓解高糖对HPMC的毒性作用。     

高糖对腹膜间皮细胞β-连环蛋白及骨桥蛋白表达的作用

目的 观察高糖对大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cell RPMC)中β-连环蛋白(β-Catenin)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)2者mRNA及蛋白表达的影响.方法 胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组.分为:正常对照组;不同浓度葡萄糖(1.5%,2.5%,4.25%) 组作用24h;2.5% 高糖作用不同时间(8,12,24,34,48 h)组,细胞免疫组织化学法检测β-Catenin蛋白在细胞上的表达情况,RealTime-RT-PCR 技术检测β-Catenin、OPN、TGF-β1mRNA的表达.ELISA法检测OPN蛋白表达.结果高糖刺激下RPMC 的β-catenin表达增加,与0 h 组比较,在8h即出现(但不具有统计学意义),12h具有统计学意义,24h达到高峰,48h 仍存在,组间差异均有统计学意义(P＜0.05);高糖可刺激RPMC OPN 的表达显著增加,呈剂量、时间依赖性(P＜0.05);TGF-β表达增加,在8h表达于较高水平,12h降低,24h达到高峰,48h仍存在,与0 h组比较,组间差异均有统计学意义(P＜0.01);高糖刺激下,β-Catenin、TGF-β1 表达显著增加,呈剂量依赖性,组间差异具有统计学意义( P＜0.05).结论 高糖通过上调β-Catenin、OPN的表达,引起腹膜损伤导致腹膜纤维化,β-Catenin、OPN参与了腹膜间皮细胞透析相关性腹膜纤维化的病理过程.     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞整合素连接激酶、结缔组织生长因子及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的研究高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)整合素连接激酶(integrin liked kinase,ILK)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的情况,为防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供新的思路。方法胰蛋白酶消化法原代及传代培养RPMC,经鉴定后第2代用于实验。细胞随机分组:①正常对照组;②高糖组:不同浓度的高糖(1.5%、2.5%、4.25%)作用24h;2.5%高糖分别作用RPMC12h、24h、48h、72h。实时定量PCR检测ILK及α-SMAmRNA的表达。Western印迹法检测ILK蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中CTGF的表达。结果与正常对照组相比,高糖可刺激RPMCILK及α-SMA的表达增高(均P<0.05),高糖诱导RPMCCTGF的表达增高(P<0.05)。结论高糖可上调RPMCILK、CTGF及α-SMA的表达。ILK及CTGF参与了高糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞腹膜纤维化过程,为防治腹膜透析相关性腹膜纤维化提供新的思路。     

维生素E对高糖诱导人腹膜间皮细胞纤维连结蛋白表达及活性氧生成的影响

持续不卧床腹膜透析（CAPD）是目前治疗终末期肾病（ESRD）的主要替代治疗方法之一,以往的研究已表明高糖可导致腹膜间皮细胞损伤,细胞外基质产生增多,最终导致腹膜纤维化。高糖引起腹膜纤维化的机制至今尚未阐明。氧化应激（OS）是指由于促氧化与抗氧化系统两者平衡失调导致活性氧（ROS） 过度产生造成的组织损伤。研究已经证实腹膜透析患者普遍存在氧化应激。     

外源性硫化氢对高糖诱导人腹膜间皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的外源性硫化氢(H2S)对高糖诱导人腹膜间皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法用4.25%D-葡萄糖(高糖)和5×10-5、10-4、5×10-4、10-3和5×10-3mol/L的外源性H2S供体硫化氢钠(NaHS)处理人腹膜间皮细胞株HMrSV5细胞24h,MTT比色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞内的内活性氧(ROS)水平,检测细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果与对照组比较,高糖组HMrSV5细胞活力显著降低(t=3.67,P<0.05),细胞培养液中LDH水平显著增加(t=2.94,P<0.05),ROS水平显著增加(t=4.28,P<0.01),MDA含量显著增加(t=2.84,P<0.05)而SOD活性降低(t=3.57,P<0.01)。与高糖组比较,5×10-4、10-3和5×10-3mol/L的NaHS显著抑制了高糖诱导的HMrSV5细胞活力的降低(t1=2.43;t2=3.68;t3=3.12,均P<0.05)和细胞培养液中LDH水平的增加(t1=2.83;t2=3.71;t3=3.44,均P<0.05)。与高糖组比较,10-3mol/L的NaHS显著抑制了高糖诱导的细胞内ROS(t=3.12,P<0.05)和MDA水平的增加(t=2.59,P<0.05)和SOD活性降低(t=2.61,P<0.05)。结论外源性H2S抑制了高糖诱导的人腹膜间皮细胞损伤,其机制可能与外源性H2S抑制氧化应激有关。     

腹膜透析液对于腹膜间皮细胞的影响

作为治疗尿毒症的有效手段之一,腹膜透析可以有效地纠正尿毒症患者的部分生理异常。而在此治疗过程中,由于腹膜透析液的组成有别于人体的体液,因而具有一定程度的生物不相容性,其非生理性的主要因素包括低pH、高糖、高渗、缓冲剂的组成等。这些因素可以导致腹膜细胞发生形态、功能的改变,腹膜透析效能降低,损害宿主的防御机制。以往的研究较多关注腹腔内的中性粒细胞、巨噬细胞;近年来,通过对于腹膜透析时人腹膜间皮细胞(HPMC)形态与功能的研究,发现HPMC在腹腔局部     

黄芪对腹膜透析相关腹膜间皮细胞VEGF分泌和表达的影响

【目的】了解黄芪注射液对体外培养的人腹膜间皮细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)分泌及其mRNA表达的影响。【方法】取择期手术患者的网膜间皮细胞体外培养,第三代细胞用于实验。细胞同步后分五组观察,对照组为加入等量的RPMI1640与完全培养基,PDS组加入等量的PDS与完全培养基;黄芪1组加入等量的含黄芪注射液(10 mg/ml)的PDS与完全培养基;黄芪2组加入等量的含黄芪注射液(20 mg/ml)的PDS与完全培养基;黄芪3组加入等量的含黄芪注射液(40 mg/ml)的PDS与完全培养基。细胞培养24 h后,用ELISA的方法检测细胞上清液中VEGF的含量并比较。用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法检测VEGF mRNA表达情况并比较。【结果】VEGF在对照组的浓度显著低于PDS组[(39.40±11.34)VS(86.64±21.64)ng/mg(P<0.05)]。腹膜间皮细胞经含不同浓度黄芪注射液的PDS干预后,VEGF的分泌与PDS组比较有显著下降,在黄芪1、2、3组分别为(63.98±13.51)ng/mg,(49.76±13.51)ng/mg和(42.38±18.05)ng/mg(均P<0.05)。黄芪2组和3组显著低于黄芪1组(P<0.05)。黄芪3组和2组比较呈下降趋势但无显著差异(P>0.05)。VEGFmRNA表达在PDS组最高,比对照组上升(42.33±11.27)%,显著高于黄芪1,2,3组的(23.81±6.77)%,(14.67±4.32)%和(10.69±5.90)%(P<0.05)。黄芪2组和3组显著低于黄芪1组(P<0.05)。黄芪3组和2组比较呈下降趋势但无显著差异(P>0.05)。【结论】黄芪注射液具有抑制PDS导致的腹膜间皮VEGF过度分泌和表达的作用。     

活性氧在高糖诱导人腹膜间皮细胞产生IL-8、MCP-1中的作用

目的 研究高糖对培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMC)产生趋化蛋白IL-8(白介素-8)、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)的影响以及内源性活性氧(过氧化氢)在其中的作用。方法 分别用不同浓度的葡萄糖、高渗甘露醇、葡萄糖加抗氧化剂(丙酮酸)刺激细胞,用半定量RT-PCR的方法测定趋化蛋白的基因水平,用ELISA的方法测定蛋白水平。结果 高糖可以使HPMC产生IL-8、MCP-1增加,且呈浓度依赖性,而高渗甘露醇的作用则不明显;高糖中加入抗氧化剂(丙酮酸)后,IL-8的表达下降,而MCP-1的表达未见明显的改变。结论 高糖可以使HPMC表达IL—8、MCP-1增加,从而在透析液生物不相容性及腹膜纤维化中起作用;在IL-8的产生中,内源性的活性氧可以作为信号传导分子,起到一定的作用。丙酮酸能够通过对抗内源性氧化应激,对HPMC具有保护作用。     

肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞的增殖及其表达白细胞介素-1中的作用

目的 初步观察肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞(Rat pcritoneal mesothelial cells，BPMC)细胞增殖及其表达白细胞介素—1(Interleukin-1,IL-1)中的作用，从而为持续性非卧床腹膜透析(Continuous ambulatory pcritoncal dialysis，CAPD)中肝素的临床应用打下一定的理论基础。方法 建立BPMC的体外培养；并用四四氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验和酶联免疫吸附方法(ELISA)，来分析肝素对高糖(3．86％葡萄糖)影响RPMC增殖及其分泌IL—1的作用。结果 3．86％葡萄糖能显抑制BPMC的增殖，而1．25U／ml肝素能部分逆转高糖对RPMC增殖的抑制作用(P＜0．01)；3．86％葡萄糖能显增加BPMC表达IL—1β，而1．25U／ml肝素能部分减少高糖增加BPMC表达IL-1β的作用(P＜0．01)。结论 本结果提示，肝素可能通过逆转高糖对BPMC的增殖抑制作用及减少高糖增加RPMC表达促炎细胞因子IL—1的作用，而延续CAPD相关性腹膜纤维化的发生，最终有益于CAPD进行。     

钙对人腹膜间皮细胞损伤、增殖及纤维连接蛋白合成的影响

目的研究不同浓度钙对体内外人腹膜间皮增殖、损伤和间质纤维化的影响。方法体外试验:以人腹膜间皮细胞永生化细胞株(HMrSV5)为研究对象,予不同浓度钙(0、0.25、0.75、1.25、1.75、2.25mmol/L)处理该细胞12、24h。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)评估细胞的增殖能力和损伤。蛋白免疫印迹法检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达。临床试验:随机选择47例既往使用低钙透析液(Baxter PD4,含钙1.25mmol/L)的稳定维持性腹膜透析患者,平均透析时间为(18.5±11.7)个月。采用前后自身对照法进行研究。以患者刚入选本研究时作为对照组,入选后换用含钙1.75mmol/L的PD2进行透析(其他成份均与PD4相同)4周,其他治疗(降压、降磷、活性维生素D3等)不变。患者使用PD2透析后的每一周末作为一组(分别为第1、2、3、4周组)。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测腹膜透析引流液中的FN和LDH,电化学发光法(electrochemiluminescence assay,ECLA)检测CA125。同时检测血清钙、磷及全段甲状旁腺激素(intact parathyroid hormone,iPTH)水平。结果体外试验:钙呈时间及浓度依赖性促进HMrSV5增殖,含钙1.75mmol/L组最高;不同浓度钙呈时间依赖性显著诱导LDH上调,其中钙1.25mmol/L组LDH最低(P<0.05);FN亦呈钙浓度及时间依赖性表达上调。临床试验:4个试验组腹膜透析引流液中LDH值均与对照组有显著差异且呈时间依赖性升高。第4周组的FN和LDH水平显著高于其他组,CA125水平明显低于其他组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。第4周组的血清钙高于对照组,血磷低于对照组差异均有统计学意义(均P<0.05),iPTH与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论在体内外试验中,高钙(1.75mmol/L)可促进人腹膜间皮细胞增殖,同时加重细胞损伤,促进FN合成,而生理浓度钙(1.25mmol/L)对人腹膜间皮细胞有一定保护作用并可能预防腹膜纤维化。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨高浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化（EMT）的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含60、120 mmol/L葡萄糖的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含120 mmol/L甘露醇的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cad-herin、α-SMA、Collagen I mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果高浓度葡萄糖（60、120 mmol/L）刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加（P〈0.05）;大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cad-herin蛋白表达水平显著下降（P〈0.05）。结论高浓度葡萄糖能上调α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达,高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化

目的探讨高浓度葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化(EMT)的影响,建立大鼠腹膜间皮细胞EMT模型。方法体外培养的大鼠腹膜间皮细胞经含60、120 mmol/L葡萄糖的M199培养基分别培养48、72 h;以正常M199培养基和含120 mmol/L甘露醇的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变,应用实时定量PCR法检测间皮细胞E-cad-herin、α-SMA、Collagen I mRNA的表达;应用Western印迹法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果高浓度葡萄糖(60、120 mmol/L)刺激后,大鼠腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞;大鼠腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加(P0.05);大鼠腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和E-cad-herin蛋白表达水平显著下降(P0.05)。结论高浓度葡萄糖能上调α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达,高浓度葡萄糖诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT。     

蛋白激酶C对高糖作用下腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1调节作用

目的观察蛋白激酶C(PKC)对高糖作用下体外培养的大鼠腹膜间皮细胞(PMCs)胞膜上葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达的调节,以探讨长期腹膜透析时如何避免腹膜损伤、改善腹膜透析疗效。方法胰酶消化法提取雄性Wistar大鼠的PMCs细胞进行培养,分别加入不同浓度葡萄糖及PKC抑制剂Go6976,间接免疫荧光法检测PMCs上GLUT1表达,流式细胞仪检测作用前后细胞膜上GLUT1量的改变,生化分析仪检测培养液内葡萄糖浓度的变化。结果高糖可增加细胞膜上GLUT1的表达,同时伴有PMCs对葡萄糖的转运增加(P0.05)。Go6976明显抑制了高糖对GLUT1的诱导,且葡萄糖的转运亦下降。结论葡萄糖以浓度依赖方式上调PMCs细胞膜上GLUT1的蛋白表达,同时伴有PMCs对葡萄糖转运的增加。PKC通路在其中发挥重要作用,应用PKC抑制剂可拮抗高糖对GLUT1表达的诱导作用。     

血必净对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞增殖及细胞因子表达的影响

目的观察血必净对高糖刺激后腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells,PMC)增殖、高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法原代培养PMC;并用MTT和ELISA法测定血必净对高糖(2.5%葡萄糖)作用下PMC增殖及其分泌HMGB-1、TGF-β1的影响。结果高糖能显著抑制PMC的增殖(P<0.05),而2～20mg/mL的血必净能部分逆转高糖对PMC增殖的抑制作用(P<0.05);高糖能显著增加PMC表达HMGB-1和TGF-β1(均P<0.05),2～20mg/mL的血必净能明显减弱高糖上调HMGB-1和TGF-β1的作用(均P<0.05)。结论血必净可能通过逆转高糖对PMC的增殖抑制作用,抑制高糖上调PMC表达炎症介质HMGB-1和致纤维化因子TGF-β1的作用,进而修复高糖所致的PMC的损伤,延缓腹膜纤维化,为改善间皮细胞损伤和防治腹膜纤维化提供实验依据。     

高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞Ang-2、Tie-2、VEGF的变化及氯沙坦对其的影响

目的:研究高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞血管生成素-2(Ang-2)和其受体Tie-2及血管内皮生长因子(VEGF)的变化以及血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦对其的影响.方法:细胞同步化后分为对照组(含糖5.5 mmol/L)、甘露醇组(含糖5.5 mmol/L +19.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(含糖30 mmol/L)、氯沙坦组(含糖30 mmol/L + 10-5 mol/L 氯沙坦),培养48 h.real-time PCR法检测Ang-2、Tie-2、VEGF mRNA表达,western blot法检测Ang-2、Tie-2、VEGF蛋白表达. 结果:Ang-2、Tie-2、VEGF mRNA和蛋白在对照组及甘露醇组仅有少量表达,而在高糖组明显升高(P ＜ 0.05),氯沙坦组Ang-2、Tie-2、VEGF mRNA和蛋白的水平较高糖组出现下调(P ＜ 0.05). 结论:Ang-2及VEGF参与糖尿病肾损害的发生,氯沙坦可能通过下调这些血管生长因子的表达发挥肾保护作用.