蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

铁蛋白轻链的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的:构建FTL的原核表达载体,获得FTL纯化蛋白,制备抗体,为研究其生物学作用奠定基础.方法:采用基因重组技术将PCR扩增的FTL基因产物与原核表达载体pET30a( )连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果,用IPTG诱导蛋白表达,将融合蛋白纯化后,免疫日本大白兔,制备FTL多抗,采用Western印迹法检验抗体特异性.结果:成功地构建了FTL的原核表达载体,经大肠杆菌中诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到较纯的相对分子质量约25 800的融合蛋白,免疫日本大白兔后得到多抗血清,Western印迹结果显示此多克隆抗体与FTL蛋白特异性结合.结论:本研究获得FTL纯化蛋白,制备了FTL多克隆抗体,为进一步研究FTL的作用机制及其在肺癌组织中的表达情况奠定了基础.     

人Lrp蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备人Lrp蛋白多克隆抗体. 方法:克隆全长lrp-cDNA编码序列并进行原核表达与鉴定. 用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白,获得纯度较高的目的蛋白. 用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分. 结果:Western印迹结果表明,纯化前后的抗血清在69 ku处均检测到目的蛋白条带,说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合. 而纯化后抗体Western印迹结果目的条带只有一条,说明吸附纯化后得到高特异性抗血清,其免疫印迹的效价在10-6以上,有较高免疫印迹滴度. 结论:成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体,为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.     

FKBP38的原核表达、抗体制备及其应用

目的 构建人FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物,制备兔多克隆抗体并对该抗体用于Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测进行评价,为研究FKBP38的功能奠定基础.方法 以人FKBP38 cDNA为模板,根据人FKBP38全长cDNA系列,设计PCR引物分别扩增N-末端(1-207aa)及C-末端(209-387aa),将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P1中,经BamH I/Sa1 I双酶切鉴定.GST-FKBP38-N及GST-FKBP38-C融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化.使用纯化的抗FKBP38多抗以Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测FKBP38的表达与细胞内的定位.结果 成功构建FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体,表达并纯化了GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白,制备并纯化了FKBP38特异性抗体.该抗体用于Western免疫印迹检测FKBP38在不同细胞株中的表达,特异性强、效价高;用于免疫荧光检测FKBP38在细胞内主要定位于线粒体上;用于免疫组织化学检测FKBP38在乳腺组织细胞呈现胞浆阳性.结论 FKBP38特异性抗体制备成功,该抗体可用于FKBP38的免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测,为深入研究FKBP38的功能奠定基础.     

人睾丸特异表达基因TDRG1 单克隆抗体的制备及鉴定

目的：构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体（mAb）并鉴定其生物学特性。方法：用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体（mAb）。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western 印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。 结果：成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western 印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论：所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。     

人高尔基体蛋白GP73基因的克隆?表达?单克隆抗体的制备及鉴定

目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物?通过克隆?表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性?方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白?以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体?以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平?结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73 单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高?结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础?     

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-ALT1融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗ALT1的单克隆抗体,用间接ELISA、Dot-Elisa、Western blot等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得1株能稳定分泌抗ALT1单克隆抗体的细胞株8A9,亚类鉴定这种单抗为IgG2.间接ELISA法测定细胞株腹水抗体的效价为10×10~5.Dot-ELISA、Western blot显示ALT1单克隆抗体能特异性地识别免疫原.结论 成功制备ALT1单克隆抗体.     

人血管生成素相关蛋白2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein 2,ARP2)的单克隆抗体.方法:用RT-PCR方法获取人脾脏组织ARP2基因序列,构建pET32a-ARP2,经电穿孔导入大肠杆菌诱导表达,获得可溶蛋白样品和包涵体蛋白样品,回收、纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立产生ARP2抗杂交瘤细胞株,Western印迹鉴定.结果:获得融合蛋白的相对分子质量为570 000,与理论计算值相符,纯化后蛋白浓度＞90%,杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:104,腹水抗体效价为1:107～1:108,抗体亚型为IgG2a类,Western印迹示目的蛋白相对分子质量为570 000,免疫组化显示该抗体能特异结合人ARP2.结论:制备的抗ARP2单克隆抗体可用于ARP2蛋白鉴定.     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

抗oh8dG单克隆抗体的制备及生物学特性研究

目的 :制备抗 8-羟基 - 2′-脱氧鸟苷 (oh8d G)的单克隆抗体 ,并通过免疫组化检测胃粘膜中的 oh8d G,评价幽门螺杆菌 (Hp)感染与 DNA氧化损伤的关系。方法 :以 BSA- oh8d G偶联物免疫 BALB/ C小鼠 ,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体 ,以竞争性 ELISA、Western blot和免疫组化进行生物学特性鉴定。结果 :建立了两个抗 oh8d G的单克隆抗体杂交瘤细胞株 (ZMC9,ZMD11) ,竞争性 ELISA和 Western blot显示该抗体对 oh8d G有高度特异性 ,免疫组化结果显示 oh8d G在 Hp阳性胃粘膜组织中表达率为 5 5 % ,Hp阴性胃粘膜组织中表达率为 5 % ,两者差异有显著性 (P<0 .0 1)。结论 :本研究制备的单克隆抗体能特异识别 oh8d G;Hp感染可导致胃粘膜组织 oh8d G水平增高。     

应用Protein A亲和层析法制备及纯化R1JHL单克隆抗体

[目的]制备、纯化N-甲基D-门冬氨酸受体（NMDAR,NR）主亚基RIJHL单克隆抗体。[方法]NR1杂交瘤细胞腹腔注射BalB／C小鼠制备抗体,Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析纯化单抗,Western-blot鉴定该单抗特异性。[结果]纯化后单抗识别大鼠脑组织膜蛋白中约115kD大小的单一条带。[结论]制备、纯化了具有高度特异性的抗NR1单克隆抗体,为进一步研究NMDA受体提供了工具。     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

肿瘤内皮细胞标志物8单抗的制备及组织分布

目的　制备特异性抗人肿瘤内皮细胞标志物 8(TEM8)单克隆抗体 ;检测TEM 8蛋白在部分肿瘤和正常组织中的分布。方法　原核表达含TEM 8膜外段多肽的融合蛋白 ,免疫Balb/c雌性小鼠后取效价较高的小鼠脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞进行细胞融合 ,以ELISA、Westernblot筛选、鉴定分泌特异性抗TEM8的单克隆杂交瘤细胞株 ;ABC免疫组织化学方法检测TEM 8蛋白表达产物在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌旁组织等组织中表达。结果　共获得 5株稳定分泌TEM 8抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ;TEM 8在多种组织细胞表达 :结肠癌新生血管 (4 / 2 3) ,结肠癌癌性腺上皮 (8/ 2 3) ,结肠癌旁组织腺上皮 (6 / 17) ,结肠组织平滑肌 (17/ 37) ,前列腺癌腺上皮 (1/ 17)。结论　成功制备抗人TEM 8单克隆抗体 ;TEM8在蛋白质水平并非肿瘤血管特异性标志物     

抗人抗苗勒管激素N端439～451表位单克隆抗体的制备及其性能研究

  目的  制备抗人抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone,AMH）N端特定表位肽的特异单克隆抗体并对其特性进行鉴定。  方法  利用生物信息分析软件预测AMH特定多肽片段,合成AMH成熟N端区域的4个抗原性好的表位肽段作为筛选靶抗原。用重组AMH蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与SP/20细胞进行细胞融合,通过杂交瘤技术制备抗AMH单克隆抗体,用N端4个表位肽（表位1:439～451 RGRDPRGPGRAQR,表位2:273-285 PPRPSAELEESPP,表位3:42～54 DLDWPPGSPQEPL,表位4:494～506 WPQSDRNPRYGNH）分别作抗原,间接ELISA和Western blot对筛选获得的特异抗表位单抗的抗原结合特性进行鉴定。  结果  筛选到两株能够稳定分泌抗人AMH表位1（anti-AMH-1）和表位2（anti-AMH-2）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单抗分别命名为anti-AMH-1和anti-AMH-2。该2株单抗细胞表达纯化后,检测其抗体效价分别为1∶12 000和1∶1 600。Western blot确认两种单抗除效价有差异外,识别抗原也有差异,anti-AMH-1不但能识别AMH的N端439-451表位肽,而且能识别重组AMH的氨基酸序列（rAMH）,也能识别卵巢组织。anti-AMH-2能识别rAMH和卵巢组织。  结论  成功构建了抗人AMH N端的特异表位的2种单克隆抗体。     

抗人FXYD6特异性多肽单克隆功能性抗体制备及生物学作用鉴定

目的 研制抗人转运调节因子(FXYD)6功能区单克隆抗体库,筛选分泌胞内、胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株并对鉴定胞外区单克隆抗体生物学作用.方法 原核表达并纯化去除跨膜区域FXYD6功能区重组蛋白,FXYD6重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,多次筛选及克隆化,建立稳定分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区的单克隆抗体杂交瘤.分别应用间接酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot和免疫组织化学法鉴定抗体特异性及亚型,细胞流式技术筛选可识别天然构象的胞外区单克隆抗体,用腹水诱导法对胞外区单抗进行制备、纯化并检测亲和常数,高表达FXYD6的HepG2细胞系检测胞外区单抗的功能.结果 成功获得分泌抗人FXYD6胞外区或胞内区单克隆抗体的杂交瘤细胞库,制备出具有功能阻断性的胞外区单抗.结论 制备的抗人FXYD6胞外区单抗可抑制HepG2细胞的增殖.     

周围神经43kD蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备周围神经43kD蛋白单克隆抗体。方法：通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶系统,从周围神经组织中分离回收43kD蛋白作为抗原,免疫BALB／C小鼠,通过杂交瘤技术,点膜印迹法检测,获得相应的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以Western blot方法检测抗体的特异性。结果：阳性克隆可持续稳定分泌抗43kD蛋白抗体,Western Blot显示在43kD处出现特异的阳性反应条带。结论：建立了分泌抗43kD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了43kD蛋白单克隆抗体。     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

PAGE-4单克隆抗体的制备及表达分布

目的:制备抗PAGE-4 mAb并鉴定其特异性及敏感性,应用该抗体在蛋白质水平上分析PAGE-4在正常与疾病组织中的表达. 方法:以PAGE-4为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立稳定分泌抗PAGE-4 mAb的杂交瘤细胞系. 采用Western Blot及ELISA等方法鉴定抗体的特异性和敏感性. 应用正辛酸-饱和硫酸铵方法纯化抗体. 利用免疫组织化学方法对PAGE-4在正常与疾病组织中的表达进行分析. 结果:获得4株分泌特异性抗PAGE-4 mAb的杂交瘤细胞株,mAb具有较高的特异性与敏感性. 在正常男女生殖系统组织如:睾丸、前列腺、子宫中以及正常胰腺组织中有PAGE-4的表达,在前列腺癌、子宫内膜腺癌中PAGE-4高表达. PAGE-4在蛋白质水平上的表达格局与以往有关PAGE-4在mRNA水平上的报道一致. 结论:成功获得抗PAGE-4 mAb,为研究PAGE-4定位及功能提供了重要工具.     

特异性SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位初步分析

目的：用分段表达纯化的SARS冠状病毒（SARS-CoV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid N蛋白）制备针对该蛋白不同区域抗原表位的高特异性单克隆抗体（McAb）,初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。方法：用分段表达纯化的SARS～CoV的N蛋白（分别记为N1蛋白、N2蛋白）分别免疫Balb／c小鼠制备McAb,通过检测其亚类、效价及相对亲和力鉴定McAb的生物学特性,以Western blot鉴定单克隆抗体特异性,并对McAb结合表位进行初步分析。结果：筛选出7株抗SARS-CoV N1蛋白及2株抗SARS-CovN2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定6株为IgG1,2株为IgG2b,1株为IgG3,腹水效价10^5以上;亲和常数达10^8以上。Western blot证实所获的单克隆抗体可与SARS-CoVN蛋白发生特异性反应。ELISA相加实验结果显示2株N1 McAb识别相同的抗原表位,其余均识别不同的抗原表位。结论：通过分段表达纯化的SARS-CoVN蛋白而制备的特异性针对SARS-CoV N蛋白不同区域抗原表位的单克隆抗体中,N1单抗识别N蛋白N端（1-549bp）,N2单抗识别N蛋白C端（496～1269bp）,可初步定位单克隆抗体识别表位所在区域。