组织工程技术构建角膜基质层的实验研究

目的探索组织工程技术构建角膜的可行性,并为其提供构建角膜的理论依据和参数.方法应用组织工程方法构建角膜基质层.对兔角膜组织行体外分离获得角膜基质细胞,经培养扩增后接种于聚羟基乙酸生物支架上,然后将角膜基质细胞-生物材料复合物植入裸鼠皮下,6周后将植入物取出,行免疫组织化学染色及胶原纤维图像分析.结果光镜下,角膜基质细胞-生物材料复合物在裸鼠皮下所形成的新生组织呈网状板层结构.免疫组化染色新生组织Ⅰ型胶原表达阳性;胶原纤维图像分析,新生组织胶原纤维直径(27.7±6.20)nm与正常角膜胶原纤维直径(28.5±3.52)nm基质层相近.结论组织工程方法所构建的角膜基质组织已具备角膜基质层的组织学特征.     

组织工程技术构建兔角膜基质组织的实验研究

目的 探讨应用组织工程技术构建兔角膜基质层组织的可行性。方法 新西兰大白免40只,即母兔及其亲生子兔共20对。分离获取新生子兔角膜基质细胞,扩增、培养,汇合后,接种于聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,移植于对应的母兔角膜基质层。绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质细胞,示踪角膜基质构建过程。同时,对侧角膜仅行PGA移植,作为材料对照组。8周后取材,行组织学切片,Western blot检测Ⅰ型胶原及电镜下测定胶原纤维直径分布。结果术后8周,实验侧角膜逐渐恢复透明,形成新生角膜基质样组织,胶原与角膜表面平行,排列较整齐,组织学结构接近正常基质组织。实验组Western blot检测提示新生组织中基质细胞表达Ⅰ型胶原;电镜下胶原纤维直径[(29.0±4.7)nm]与正常角膜基质组织比较[(28.5±3.5)nm],差异无显著意义(P>0.05)。对照组正常角膜无新生基质组织形成。GFP标记角膜基质细胞,示踪角膜基质第8周时,荧光显微镜下可见新生组织呈绿色,提示GFP表达。结论 应用组织工程技术可以在兔受体角膜内构建角膜基质层组织。(中华眼科杂志,2004,40:517-521)     

组织工程角膜基质的体外构建及移植的实验研究

目的探讨利用组织工程技术体外构建角膜基质进行板层角膜移植的可行性和有效性。方法将猪角膜基质去细胞处理后制备成组织工程角膜基质载体;取幼兔角膜基质细胞体外培养,将其种植在载体上,体外构建成组织工程角膜基质,用PKH26荧光标记兔角膜基质细胞示踪角膜基质的构建;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成无菌性角膜溃疡,随机从16只兔中选8只,进行组织工程角膜基质移植;另外8只作为对照组,进行新鲜的同种异体兔板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、光学显微镜、透射电镜观察。结果体外构建的组织工程角膜的基质细胞具有活性,其结构与正常角膜基质相近。移植治疗无菌性角膜溃疡术后,1~2周有新生血管侵入组织工程角膜基质植片边缘,植片为灰白色半透明状;3~4周随着新生血管减退,组织工程角膜基质植片局部开始透明变薄;术后8~10周角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,角膜神经可再生;观察最长达10月,角膜仍保持透明,无免疫排斥发生,与对照组疗效相同。结论体外构建的组织工程角膜基质无免疫原性、具有良好的生物相容性,可作为临床治疗角膜溃疡的移植材料。     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

脱细胞角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮组织的实验研究

目的 比较氯化钠(NaCl)-十二烷基硫酸钠(SDS)-胰蛋白酶与分散酶(Dispase)-聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)两种角膜组织脱细胞方法的效果,探讨以脱细胞角膜基质为支架构建组织工程化角膜上皮组织的可行性.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,分别用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase-Triton-X-100处理兔角膜组织,使用裂隙灯显微镜、光学显微镜及透射电镜观察经两种方法处理后的角膜基质特性和脱细胞效果.以兔角膜缘上皮细胞为种子细胞,Dispase-Triton-X-100处理的猪角膜前弹力层与基质为支架,体外重建兔角膜上皮细胞层,并进行形态学、组织病理学及免疫组织化学检测.结果 两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似,灰白色不透明,水肿明显,质地柔软.组织病理学和超微形态学观察显示两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整,NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞碎片,而Dispase-Triton-X-100处理的角膜组织未见基质细胞碎片.兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层与基质上,24 h角膜上皮细胞开始游出,3～4 d融合呈片状,7～8 d形成单细胞层.组织工程化角膜上皮细胞表达CK3.结论 Dispase-Triton-X-100处理方法的角膜组织脱细胞效果良好.以脱细胞猪角膜前弹力层与基质为支架.可在体外构建组织工程化兔角膜上皮组织.     

Smile来源的角膜基质透镜构建组织工程角膜基质支架的实验研究

目的:探究用全飞秒激光小切口微透镜摘除术(Smile)来源的角膜基质透镜构建组织工程角膜基质支架的可行性及最佳保存条件。方法:从Smile来源的角膜基质透镜中分离培养人角膜基质细胞(HCFs),采用MTT法检测人纤维蛋白粘合剂(FS)对细胞的毒性作用;将FS粘贴双层角膜基质透镜构建的双层透镜支架分别置于不同介质(无水甘油、透明质酸钠、胎牛血清、模拟湿房环境)及不同温度(常温、4℃、-20℃)中保存,对比支架透明度及硬度。结果:MTT检测结果显示,FS作用0~72h,HCFs与正常培养细胞具有相似的增殖趋势,细胞毒性评级为0~1级,相对生存率均超过90%。FS粘贴的双层基质透镜支架表面平整、贴合紧密、透明度良好且硬度适宜。4℃保存14d后,无水甘油中9枚支架复水后均未出现开裂情况,透明度良好;透明质酸钠中9枚支架中3枚出现开裂,剩余6枚完整,透明度尚可;模拟湿房环境中9枚支架均无开裂现象,但皱缩严重;胎牛血清中9枚支架全部开裂,水肿严重。保存14d后,常温无水甘油中的15枚支架其中2枚保持无色透明,5枚轻微变黄但透明度尚可,8枚严重变黄且透明度明显降低;4℃无水甘油中的15枚支架其中5枚无色透明,10枚轻微变黄且透明度良好;-20℃无水甘油中的15枚支架均保持无色透明状态,未出现变黄情况。结论:FS是一种安全无毒的生物胶,可利用FS粘贴Smile来源的角膜基质透镜构建稳定性好、透明度高且硬度适宜的角膜基质支架,且-20℃无水甘油是角膜基质透镜支架的较佳保存条件。     

应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的 应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪。方法 构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞-生物材料复合物，移植于母兔角膜基质板层内。术后8周，组织学切片，HE染色，荧光显微镜下对绿色荧光蛋白(GFP)进行示踪观察。结果 8周后，组织工程化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下见新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论 组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似。新生组织表达GFP，证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞。     

角膜基质细胞—PGA生物支架复合体外培养研究

目的 研究角膜基质细胞与PGA亲和力,为组织工程技术建构角膜提供重要的理论依据和参数。方法 体外分离获得角膜基质细胞,经培养扩增后接种于PGA,并对细胞－生物材料复合物进行体外培养,观察细胞生长代谢。应用MTT技术测定角膜基质细胞与PGA的黏附率。结果 角膜基质细胞能够在PGA中黏附、伸展和分泌基质,MTT测得细胞黏附率为71．40％。结论 角膜基质细胞与PGA具有较好的亲和力,PGA可以作为构建角膜的生物材料。     

组织工程角膜上皮移植治疗兔角膜碱烧伤的形态学观察

目的:探讨组织工程角膜上皮移植治疗角膜碱烧伤的疗效和时机。方法:1mol/LNaOH制作改良兔角膜碱烧伤模型21只42眼,分对照组和移植组,移植组分别在碱烧伤后1,3,6,9d(早)和14d(中)行自体或同种异体组织工程角膜上皮移植术,比较移植组及对照组烧伤后28d内眼表和组织病理学变化。结果:角膜碱烧伤后7d开始出现角膜上皮的大片脱落,14d角膜上皮大片脱落或溃疡发生率达72%,持续至28d,而移植组在28d时发生率仅为25%,大多获得完整的角膜上皮;烧伤后早期移植组角膜基质深层炎性细胞浸润和新生血管生长较对照组明显受到抑制,而中期移植组角膜基质层较对照组并无明显差异;28d内异体组织工程角膜上皮移植的免疫排斥反应并不大于自体移植。结论:自体或同种异体组织工程角膜上皮移植均可尽快恢复眼表完整性,且烧伤后早期移植效果明显优于中期移植。     

Acellular ostrich corneal stroma used as scaffold for construction of tissue-engineered cornea

AIM: To assess acellular ostrich corneal matrix used as a scaffold to reconstruct a damaged cornea. METHODS: A hypertonic saline solution combined with a digestion method was used to decellularize the ostrich cornea. The microstructure of the acellular corneal matrix was observed by transmission electron microscopy (TEM) and hematoxylin and eosin (H&E) staining. The mechanical properties were detected by a rheometer and a tension machine. The acellular corneal matrix was also transplanted into a rabbit cornea and cytokeratin 3 was used to check the immune phenotype. RESULTS: The microstructure and mechanical properties of the ostrich cornea were well preserved after the decellularization process. In vitro, the methyl thiazolyl tetrazolium results revealed that extracts of the acellular ostrich corneas (AOCs) had no inhibitory effects on the proliferation of the corneal epithelial or endothelial cells or on the keratocytes. The rabbit lamellar keratoplasty showed that the transplanted AOCs were transparent and completely incorporated into the host cornea while corneal turbidity and graft dissolution occurred in the acellular porcine cornea (APC) transplantation. The phenotype of the reconstructed cornea was similar to a normal rabbit cornea with a high expression of cytokeratin 3 in the superficial epithelial cell layer. CONCLUSION: We first used AOCs as scaffolds to reconstruct damaged corneas. Compared with porcine corneas, the anatomical structures of ostrich corneas are closer to those of human corneas. In accordance with the principle that structure determines function, a xenograft lamellar keratoplasty also confirmed that the AOC transplantation generated a superior outcome compared to that of the APC graft.     

组织工程角膜治疗兔无菌性角膜溃疡

目的:探讨利用组织工程技术制备角膜基质进行板层角膜移植治疗无菌性角膜溃疡的可行性和疗效。方法:用去垢剂联合胰酶、DNA-RNA酶去除猪角膜基质细胞后制备成组织工程角膜基质;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成角膜溃疡,随机从16只兔中选8只行组织工程角膜基质板层移植;另外8只作为对照组,行新鲜的同种异体板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、HE染色光学显微镜检查。结果:组织工程角膜基质移植后无免疫排斥发生,术后8～10wk角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,与对照组疗效相同。结论:组织工程角膜基质具有良好的生物相容性和治疗作用。     

体外构建含细胞组织工程角膜基质的方法

目的:研究体外构建组织工程角膜基质的方法.方法:用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理猪角膜基质,在去细胞猪角膜基质材料上接种体外培养的兔角膜基质细胞,并将兔角膜基质细胞进行PKH26荧光标记,在体外构建组织工程角膜基质.用倒置荧光显微镜;HE染色光学显微镜;扫描电镜观察.结果:利用异种去细胞角膜基质组织为支架材料而构建的组织工程角膜基质具有近似正常角膜基质的三维立体结构.结论:以去细胞猪角膜基质材料为支架,利用组织工程技术可成功的在体外构建出含细胞的组织工程角膜基质组织.     

Support of acellular porcine corneal stroma for growth of corneal epithelium and stromal cell in vitro

AIM: To determine whether acellular porcine cornea stroma (APCS) could support the growth of the rabbit corneal cells in vitro . METHODS: APCS was prepared. The rabbit's corneal epithelium and stromal cells were cultured and seeded on APCS in vitro . The observation of phase contrast photograph and histological examination were performed. RESULTS: Histological examination showed the epithelium grew on the scaffold of APCS in 2-3 layers at 10th day. The stromal cells adhered to the surface of the scaffold after 24 hours and invaded into the interlaminar of the material at 5th day. CONCLUSION: These results indicate that APCS can support the growth and proliferation of the corneal epithelium and stromal cells in vitro .     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

猪脱细胞角膜基质的制备及组织学特征观察

目的:制备低抗原性、保留天然角膜结构的组织工程角膜支架材料.方法:对猪角膜进行反复冻融联合酶消化,最后冷冻干燥,观察其组织学特征.结果:制备的脱细胞猪角膜基质的细胞成分能被有效去除,材料保留了利于角膜上皮生长的基底膜和有序排列的网状的基质胶原结构,有一定的强度和韧性.结论:采用反复冻融联合酶消化、冷冻干燥法能获得一种无细胞的组织工程角膜支架材料.     

异种角膜基质作为生物角膜载体的免疫学研究

目的探讨异种(猪)角膜基质组织免疫原性,以评价其作为角膜重建载体材料的可行性。方法将新鲜、脱水2种猪角膜基质植片分别植入F344大鼠角膜基质层间,术后12d、90d抽取外周血,行抗CD25·FITC和抗CD4/CD8·PE双色免疫荧光标记,流式细胞仪测定分析。结果测得新鲜组、脱水组大鼠术后12d外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.53%±0.47%,2.13%±0.53%与0·57%±0.20%,0.67%±0.18%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.28,1.69±0.18)与同基因移植组(1.78%±0.36%,1.50±0.19)、阴性对照组(2.06%±0.52%,1.44±0.32)比较无显著性差异(P>0.05)。术后90d,新鲜组、脱水组大鼠外周血T淋巴细胞表面抗原CD4 和CD25 、CD8 和CD25 双阳性表达率(1.48%±0.39%,1.50%±0.46%与0·55%±0.15%,0·58%±0·11%)及CD4 /CD8 比值(1.43±0.51,1.36±0.59)与同基因移植组(1.32%±0·75%,1.31±0.29)、阴性对照组(1.34%±0.18%,1.44±0.42)比较,也无显著性差异(P>0.05)。结论异种(猪)角膜基质免疫原性低,是一种理想的角膜体外重建载体材料。     

组织工程角膜内皮细胞移植的研究与进展

由于角膜供体材料严重短缺以及供体年龄限制,穿透性角膜移植术的临床广泛开展受到严重制约,应用组织工程体外培养高密度、具备常规六角形态和健康内皮功能的角膜内皮细胞是当前研究的热点。本文就角膜内皮种子细胞的来源、载体的选择及角膜内皮细胞移植方法、免疫机制等方面研究的最新进展进行综述,总结目前研究面临的问题并展望其前景。