注射用免疫核糖核酸II的免疫调节及对顺铂的增效减毒作用

 目的 研究干扰素刺激基因因子3（ISGF3）在干扰素α（IFN-α）抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制机制中的作用。 方法 应用定量PCR技术检测IFN-α处理前后人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞上清HBV DNA含量，DNA印迹法检测IFN-α处理前后HepG2.2.15细胞内HBV复制中间体的变化，蛋白质印迹法检测IFN-α处理前后HepG2和HepG2.2.15细胞中ISGF3的3个组分即信号转导和转录活化因子（STAT）1、磷酸化STAT2和ISGF3γ以及双链RNA依赖蛋白激酶(PKR)蛋白质表达水平的改变。用酪氨酸酶抑制剂染料木黄酮抑制IFN-α作用后，再次进行上述检测。 结果 IFN-α处理后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和细胞内HBV复制中间体减少，HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达水平均升高。加染料木黄酮抑制IFN-α后，HepG2.2.15细胞上清HBV DNA和复制中间体无减少，而HepG2和HepG2.2.15细胞中STAT1、磷酸化STAT2、ISGF3γ和PKR蛋白质表达均减少。 结论 ISGF3是IFN-α抑制HBV复制的关键因子。     

敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移

目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。     

利金方降低大鼠Th17细胞/CD4~+ T细胞比值减轻香烟烟雾提取物引起的炎症反应

目的探讨利金方对香烟提取物诱导的CD4~+ T细胞向Th17细胞分化及对炎症的影响及作用机制。方法分离和培养CD4~+ T细胞,分为空白对照组、香烟烟雾提取物(CSE)组、(0.25、0.5、1.0)mg/mL利金方处理组、Janus激酶2(JAK2)抑制剂AG-490组、信号转导子和转录激活子3(STAT3)抑制剂TG-101348组。利金方处理组和抑制剂组都是先给予相应处理后再进行CSE刺激。流式细胞术检测各组CD4~+ T细胞、Th17细胞比例,ELISA检测CD4~+ T细胞培养基中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素17A(IL-17A)水平;实时定量PCR检测CD4~+ T细胞JAK2、STAT3、维甲酸相关孤核受体γt(ROR-γt)的mRNA水平,Western blot法检测CD4~+ T细胞JAK2、磷酸化的JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、ROR-γt的蛋白水平。结果 CSE处理增加Th17细胞/CD4~+ T细胞比值,培养基中TNF-α、IL-17A含量;ROR-γt的mRNA和蛋白表达增加,JAK2、STAT3磷酸化增加。利金方处理后降低Th17细胞/CD4~+ T细胞比值,减少TNF-α、IL-17A分泌,抑制ROR-γt的mRNA和蛋白表达以及JAK2、STAT3的磷酸化。结论利金方通过抑制JAK2-STAT3-ROR-γt通路降低Th17细胞/CD4~+ T细胞比值减轻CSE诱导的炎症反应。     

IFNγ-LTα与LTα诱导L929细胞凋亡信号转导的初步研究

目的：研究融合蛋白IFNγ-LTα诱导L929细胞凋亡的信号转导机制，并与LTα相比较。方法：用结晶紫染色法观察细胞毒效应；用检测试剂盒检测caspase 8和3活性的变化；观察3种信号转导分子的抑制剂对IFNγ-LTα和LTα诱导的细胞毒效应的影响。结果：IFNγ-LTα能诱导L929细胞凋亡及胞内caspase 8和3的活变化，但两种caspase产生的时间和幅度有所不同。PKC的抑制剂可促进IFNγ-LTα和LTα对L929细胞的杀伤；而PLA2及Ca^2 通道的抑制剂对杀伤则有明显的阻断作用，但对LTα的阻断强于对IFNγ-LTα的阻断。结论：IFNγ-LTα融合蛋白的抗肿瘤活性强于LTα，其信号转导特征有别于LTα。信号分子caspase与PKC、PLA2、Ca^2 之间可能存在关联。     

新型低密度cDNA Macroarray的建立及其应用于干扰素抗HBV的研究

目的了解人肝胚瘤细胞株HepG2和稳定转染HBV全基因组细胞株HepG2.2.15的干扰素(IFN)抗病毒基因表达谱。方法选择与IFN抗病毒及其信号转导途径相关的288个IMAGE克隆,经聚合酶链反应(PCR)扩增相应的基因片段,将扩增的DNA片段纯化后点样于阳离子尼龙膜上以制备成人工芯片。HepG2和HepG2.2.15细胞经IFN处理后,分离细胞总RNA,进行逆转录并且同时以32P标记;将标记的cDNA靶基因与尼龙膜上的探针进行分子杂交。经Cyclone扫描系统和OptiQuantTM软件处理,将图像信号转换成数据信息;再经Excel软件分析、处理形成Macroarray数据值。结果Macroarray分析提示,在HepG2和HepG2.2.15细胞仅有部分IFN诱导基因表达,多数IFN诱导基因呈低表达或不表达。通过比较HepG2和HepG2.2.15细胞,发现两者表达IFN诱导基因有差异,即对IFN应答有差异。进一步分析还发现,尽管与HepG2细胞存在差异的IFN应答,HepG2.2.15细胞的IFN信号转导途径(JakSTAT途径)却是开放的、未受损伤的。结论HepG2和HepG2.2.15细胞具有差异的IFN抗病毒基因表达谱。     

三种α干扰素亚型单抗的特性鉴定

采用中和活性法、免疫印迹法 ,通过α1b、α2b、α2a干扰素与自制的 6株单抗反应的结果差异 ,对 3种干扰素加以鉴别。中和活性结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有中和活性 ,AK2单抗只与IFN α2有中和活性 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有中和活性。免疫印迹结果表明 ,AK1单抗只与IFN α1b有印迹反应 ,AK2与IFN α2有印迹反应 ,而AK4单抗与IFN α1b和IFN α2b皆有印迹反应 ,与IFN 2a无印迹反应。AK1或AK2能够鉴别IFN α1b与IFN α2 ,AK4能够鉴别IFN α2a与IFN α2b。     

肠道病毒71 型通过下调IRF9 的蛋白水平抑制干扰素的抗病毒作用

目的:初步探讨肠道病毒71 型抑制干扰素(IFN)信号通路的具体机制,为以后EV71 的治疗提供理论基础。方法:采用EV71 感染人横纹肌肉瘤细胞(RD 细胞)模型,实验组分正常对照组(Control)、EV71 病毒对照组(EV71 组)、仅有IFN-β处理组(IFN-β组)、EV71+IFN-β处理组(EV71+IFN-β组)。采用Real-time PCR 法检测IFN 诱导基因(ISGs)的表达。细胞核蛋白和胞浆蛋白分离后应用免疫印迹法检测p-STAT1 在细胞中的分布。采用免疫印迹法检测STAT1、IRF9 的表达。结果:EV71+IFN-β组与IFN-β组相比,OAS1、MX1、ISG54 mRNA 表达水平明显降低,分别降低约47%、50%、48%,差异有统计学意义(P<0.05),提示EV71 感染抑制了IFN-β诱导的ISGs mRNA 的表达。EV71 感染并不影响STAT1 的蛋白水平和磷酸化过程。IFN-β组,p-STAT1 主要定位在胞核中,而EV71+IFN-β组的p-STAT1 主要定位在胞浆中,提示EV71 可能抑制了p-STAT1 的核转位。检测细胞总裂解液中IRF9 的蛋白水平,结果发现,在IFN-β处理的细胞中,IRF9 的表达明显上调;而与IFN-β组相比,EV71+IFN-β组IRF9 的蛋白水平明显降低,提示EV71 感染抑制了IFN-β诱导的IRF9 的表达。结论:EV71 通过降低IRF9 来抑制ISGF3 的核转位,进而阻断IFN 的抗病毒作用。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

甘草酸通过JAK/STAT1通路抑制IFN-γ诱导HaCaT细胞CXCL10的产生

目的研究甘草酸(GL)对IFN-γ诱导HaCaT细胞CXC趋化因子配体10(CXCL10)表达的影响。方法体外培养HaCaT细胞,以10 ng/m Lγ干扰素(IFN-γ)刺激HaCaT细胞,分别用0. 5 mmol/L GL、15 nmol/L CYT387及二者联合处理细胞。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测CXCL10 mRNA水平,ELISA检测CXCL10蛋白水平,Western blot法检测Janus激酶1(JAK1)、JAK2、信号转导子与转录激活子1(STAT1)的磷酸化水平。结果 GL抑制IFN-γ对HaCaT细胞的损伤,且对HaCaT细胞活力无明显影响。GL与JAK1/2抑制剂CYT387均可下调IFN-γ诱导HaCaT细胞的CXCL10表达;且与CYT387处理相比,GL及联合CYT387处理显著下调CXCL10 mRNA表达。GL下调JAK/STAT1信号通路中JAK1、JAK2以及STAT1蛋白磷酸化水平。结论推测GL可能通过阻断IFN-γ介导的JAK/STAT1信号活化,从而抑制IFN-γ诱导HaCaT细胞分泌CXCL10。     

鹅去氧胆酸和苯巴比妥对HepG2细胞MRP3与核受体RXRα蛋白表达的影响

目的通过诱导剂刺激体外培养的人肝癌细胞HepG2,观察多耐药相关蛋白MRP3(mu ltidrug resistance-assoc iatedprote in 3,MRP3)和核受体RXRα(retinoid-X receptor alpha,RXRα)蛋白的表达变化。方法用鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic ac id,CDCA)或苯巴比妥(phenobarb ital,PB)分别刺激培养的肝癌细胞HepG2后,抽提HepG2细胞总蛋白和核蛋白,W estern b lot方法检测MRP3和RXRα蛋白表达水平的变化。结果CDCA和PB可诱导HepG2细胞膜MRP3蛋白表达增高,并抑制细胞核受体RXRα蛋白表达。结论HepG2细胞中膜转运蛋白MRP3表达的上调可能与核受体RXRα表达抑制相关。     

低氧联合TNF-α通过激活STAT3而非ERK1/2途径介导人肺微血管内皮细胞凋亡

目的探讨低氧联合肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)凋亡的信号通路。方法低氧6、12、24 h及(10、20、50、100)ng/m L TNF-α分别处理HPMVEC,使用MTT比色法检测各组的细胞活性;选用最佳的低氧时间及TNF-α剂量联合刺激HPMVEC,流式细胞术检测caspase-3的活性,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)检测各组细胞的凋亡情况,采用Western blot法检测各组细胞中磷酸化信号转导子与转录因子3(p STAT3)及磷酸化胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)的水平。结果 MTT法显示,低氧24 h组的相对细胞活性最低,100 ng/m L TNF-α处理组的相对细胞活性明显降低且对细胞活性的抑制呈现剂量依赖性;选用低氧24 h及100 ng/mL TNF-α作为联合处理组,与空白对照组及单独处理组相比,联合处理组的caspase-3活性及细胞凋亡率均升高。Western blot结果显示,与空白对照组相比,联合处理组的p STAT3表达明显升高,而p ERK1/2的变化无统计学意义。而STAT3通路阻断剂S3I-201可使联合处理组的细胞凋亡率下降。结论低氧状态联合TNF-α通过激活STAT3而非ERK1/2介导HPMVEC凋亡。     

减毒活菌卡介苗通过STAT6对哮喘小鼠肺组织Th1和Th2型细胞因子的影响

目的:研究减毒活菌卡介苗(BCG)干预对哮喘小鼠呼吸道炎症、气管肺泡盥洗液(BALF)中细胞因子及肺组织信号转导和转录激活因子-6(STAT6)蛋白表达的影响。方法:将昆明小鼠30只随机分为正常对照组、哮喘组、BCG治疗组3组,每组小鼠都为10只。正常对照组以生理盐水致敏激发,以卵清白蛋白(OVA)致敏激发建立小鼠哮喘模型,BCG治疗组于OVA致敏前及后5天分别以BCG皮内注射干预,所有小鼠在最后一次抗原激发后24小时收集BALF,计数BALF中的白细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)数目,苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠肺组织病理形态学改变,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中IL-4、IFNγ-水平,以免疫组织化学法观察各组小鼠肺组织STAT6表达。结果:小鼠肺组织HE切片显示哮喘组有大量炎症细胞浸润。哮喘组、BCG治疗组小鼠肺组织STAT6蛋白表达和BALF中的白细胞总数、EOS计数、IL-4水平均较正常对照组升高(P<0.05);而与哮喘组比较,BCG治疗组肺组织STAT6蛋白表达和BALF中的白细胞总数、EOS计数、IL-4水平均降低(P<0.05)。与正常对照组比较,哮喘组BALF中的IFNγ-水平显著下降(P<0.01),而BCG治疗组BALF中的IFNγ-水平增加(P<0.05)。结论:BCG能抑制哮喘小鼠气道炎症、减少哮喘小鼠Th2型细胞因子IL-4的生成、提高Th1细胞因子IFNγ-的水平,其干预机制可能与BCG抑制哮喘小鼠肺组织STAT6蛋白的表达有关。     

HBV转染增强细胞因子上调PD-L表达

目的 研究HBV转染的肝细胞系(HepG2.2.15细胞)在细胞因子作用下能否上调PD-L表达.方法 应用肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)为模型,用IL-4、IFN-α、IFN-γ(终质量浓度均为10 ng/ml,刺激时间为12 h)作用于上述细胞系,采用RT-PCR技术检测细胞因子作用前后PD-L表达情况.结果 无论是否转染HBV,IFN-α和IFN-γ均能诱导肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)PD-L1表达;而IL-4不能诱导PD-L1表达,IL-4、IFN-α、IFN-γ均能诱导转染了HBV的HepG2.2.15细胞PD-L2表达,仅IFN-γ能诱导未转染HBV的HepG2细胞PD-L2表达.结论 IFN-α和IFN-γ有较强诱导肝细胞系(HepG2细胞和HepG2.2.15细胞)PD-L1表达上调的作用,HBV在细胞因子诱导HepG2.2.15细胞PD-L2表达中具有促进作用.     

PTEN 调控STAT3 信号通路影响心肌成纤维细胞增殖的研究

目的:研究第10 号染色体同源缺失性磷酸酶鄄张力蛋白(PTEN)对心肌成纤维细胞增殖的影响及机制。方 法:用高糖刺激心肌成纤维细胞,qRT鄄PCR 和Western blot 检测细胞中PTEN 水平。细胞转染PTEN 过表达载体,qRT鄄PCR 和 Western blot 检测转染后细胞中PTEN 水平。用高糖刺激转染PTEN 过表达载体的心肌成纤维细胞,噻唑蓝(MTT)检测细胞增 殖,Western blot 检测细胞中磷酸化的STAT3(p-STAT3)、信号转导与转录因子3(STAT3)水平,在细胞培养液中加入STAT3 通 路阻断剂AG490 处理细胞,MTT 检测细胞增殖,Western blot 检测细胞中p鄄STAT3、STAT3 水平。结果:高糖处理后的心肌成纤 维细胞中PTEN mRNA 和蛋白水平均明显低于正常培养的细胞(P<0.05)。转染PTEN 过表达载体后的细胞中PTEN mRNA 和蛋白水平均明显高于不做转染的细胞(P<0.05)。高糖作用后细胞增殖活性和p鄄STAT3 水平明显高于正常培养的细胞(P< 0.05)。PTEN 过表达后经高糖诱导,细胞增殖活性和p鄄STAT3 水平有所降低,用AG490 处理后的细胞增殖活性进一步下降。 结论:PTEN 通过抑制STAT3 信号通路,减缓高糖诱导的心肌成纤维细胞过度增殖。     

IL—4、IL—12、IL／6STAT／SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展

Th细胞分化为Th1和Th2细胞是受多种细胞因子调控的。已有研究:IL－4、IL－12和IL／6通过STAT／SOCS信号途径经对Th细胞的分化进行调节。IL－12／STAT4／SOCS3使CD4^ 和Th2和Th1分化和极化，IL－4／STAT6／SOCS1使Th0B向Th2分化。IL－6则通过STAT3可以上调CD4^ T细胞SOCS－1的表达，这是由于IL－6干扰IFN－γ受体的信号转导，阻断了IFN－γ对IFN－γ基因的自我调节，因此实现了IL－6对Th1细胞的负性调控。据此认为IL－6启动CD4^ T细胞分化与抑制CD4^ T分化为Th1细胞是两种独立的分子机制，它在平衡Th1/Th2的免疫反应中起着重要的调节作用。     

白细胞介素9通过激活信号转导子和转录激活子3(STAT3)通路促进胰腺癌细胞的增殖和迁移北大核心CSCD

目的探讨白细胞介素9(IL-9)促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移的作用及机制。方法体外培养人胰腺癌PANC-1细胞,实验组予(5、10、20)ng/m L IL-9处理24 h,对照组不予处理。采用实时定量PCR检测PANC-1细胞白细胞介素9受体(IL-9R)的m RNA水平,CCK-8法检测肿瘤细胞的增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,TranswellTM实验检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot法检测细胞中信号转导子与转录激活子3(STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白水平。STAT3抑制剂AG490预处理前后,进行IL-9处理,再采用以上方法检测细胞增殖情况以及细胞中STAT3和p-STAT3蛋白水平。结果 IL-9处理后,PANC-1细胞IL-9R m RNA水平增高、细胞增殖、侵袭和迁移能力增强,且这种促进作用随着IL-9剂量的升高而增强,但细胞凋亡率无明显改变。与对照组相比,IL-9处理后PANC-1细胞中的p-STAT3蛋白水平显著增加,但STAT3蛋白水平无明显改变。使用AG490预处理后,IL-9对PANC-1细胞增殖的促进作用减弱,且p-STAT3表达水平显著降低。结论 IL-9促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移与STAT3通路激活有关。     

miR-125b通过靶向STAT3抑制胃癌细胞SGC-7901的侵袭迁移能力

目的研究miR-125b靶向STAT3对胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移能力的影响。方法运用qPCR法检测miR-125b在胃癌及癌旁组织中的表达,运用Western blot法检测STAT3在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达,用双荧光素酶报告基因系统检测miR-125b对STAT3转录活性的影响,用Transwell实验检测过表达miR-125b对SGC-7901细胞侵袭迁移能力的影响,用Western blot法检测过表达miR-125b后SGC-7901细胞STAT3的表达变化。结果与癌旁正常组织比较,胃癌组织miR-125b的表达水平明显降低,STAT3蛋白表达水平明显升(P0.01)。双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-125b可以直接调控STAT3的转录活性。过表达miR-125b后,SGC-7901细胞的侵袭和转移能力明显降低,STAT3的表达水平下调(P0.01)。结论miR-125b可靶向STAT3的表达调控SGC-7901细胞的侵袭迁移能力。     

siRNA沉默SOCS1表达增强IFN-α2a-NGR的抗肿瘤效应

目的:研究肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR抗肿瘤效应的分子机制,发现影响干扰素敏感性的关键信号分子,提高耐药肿瘤细胞敏感性。方法:培养IFNAR高表达细胞株A549、IFNAR低表达细胞株MKN-45,通过MTT检测IFN-α2a-NGR的抗细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)、Western blot检测IFN-α2a-NGR处理前后STAT1、p-STAT1、p53、OAS与SOCS1的表达变化,合成siRNA靶向干涉SOCS1。结果:IFN-α2a-NGR刺激后,A549中,p-STAT1、p53、OAS与SOCS1表达上调;MKN-45中P53、OAS无显著变化,SOCS1显著上调。靶向干涉SOCS1后,MKN-45对IFN-α2a-NGR的敏感性增加[抑制率从(14.69±1.05)%提高到(36.97±2.05)%]。结论:IFN-α2a-NGR与IFN-α2a在细胞和分子水平的效应基本一致,p-STAT1、p53与SOCS1可影响细胞对干扰素的敏感性,通过siRNA沉默技术可提高耐药细胞株敏感性,为IFN-α2a-NGR的进一步研发奠定了基础。