用融合蛋白在大肠杆菌中高表达百日咳杆菌毒素蛋白S3亚基…

用多聚酶链反应和基因重组技术通过百日咳毒素Ｓ３亚基因和高表达质粒ＰＭＡＬ－Ｃ构建了麦芽糖结合蛋白和亚基蛋白的融合基因，并在大肠杆菌中高效表达了融合蛋白。     

百日咳杆菌毒素S1亚单位与谷胱甘肽S—转移酶融合基因在大肠杆菌 …

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌中的表达。并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１，首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

百日咳毒素亚基基因的克隆与表达及其重组亚基的免疫学特性

目的从百日咳包特杆菌ＣＳ株中克隆百日咳毒素（ＰＴ）及其各亚基的基因,并探讨在昆虫细胞中表达百日咳毒素亚基基因片段的可能性及表达产物的生物学特性。方法采用ＰＣＲ技术进行克隆,并通过限制性内切酶和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ进行分析鉴定。利用重组杆状病毒技术,在昆虫细胞Ｓｆ９中表达各亚基基因,并通过免疫荧光实验进行分析鉴定,通过ＥＬＩＳＡ实验进行重组蛋白的免疫学特性评价。结果获得百日咳毒素及其各亚基的基因,并在昆虫细胞中表达了重组亚基。经体外聚合后的各重组亚基混合物与抗天然完整ＰＴ免疫血清的反应性和诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力都明显高于各重组亚基单体混合物,含有Ｓ１重组亚基混合物诱生特异性抗ＰＴ抗体水平又明显高于不含Ｓ１重组亚基混合物的水平。说明百日咳毒素亚基单体仅具有很弱的诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力,且抗完整ＰＴ的抗血清对百日咳毒素亚基单体也缺乏很好的识别作用。结论百日咳毒素诱导产生特异性抗体的能力依赖于聚合体的空间构型,而且其主要抗原决定簇位于聚合体的Ｓ１亚基上。     

百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法的建立及应用

目的建立铕(Eu3+)标记检测百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法。方法利用原核重组表达系统表达百日咳毒素S1亚基蛋白,并鉴定,采用双抗体夹心法建立检测S1 TRFIA分析方法。结果自制S1试剂盒检测灵敏度2.5 ng/ml,与其他抗原无交叉反应,并初步可应用于百日咳疫苗中免疫原的监测。结论自制百日咳毒素S1亚基蛋白时间分辨免疫荧光分析法能够较为可靠的监控百日咳疫苗质量。     

无细胞百日咳疫苗时代百日咳杆菌黏附素蛋白缺失株的研究进展

无细胞百日咳疫苗接种后的免疫持久性下降和百日咳杆菌变异是导致"百日咳再现"的两个重要原因。百日咳杆菌变异株不表达无细胞百日咳疫苗中所包含的抗原成分,其中以黏附素蛋白的缺失最为常见。大量研究表明黏附素蛋白的缺失对百日咳杆菌的侵袭力和致病性并无明显影响,被认为可以由其他毒力因子代偿。黏附素蛋白缺失株产生的原因,包括IS481序列插入等菌株自身变异相关的分子机制,以及无细胞百日咳疫苗接种后的免疫环境造成的选择性压力。我国目前处在无细胞百日咳疫苗接种初期,尚未报道发现黏附素蛋白缺失株。     

在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素

目的 构建以融合蛋白形式在大肠杆菌中高效表达心钠素的重组质粒,稳定高效地获得基因工程产品心钠素。方法 采用PCR和亚克隆技术构建带有心钠素的融合基因并在大肠杆菌中高效表达融合蛋白。利用操纵子重复克隆提高表达量,以凝血酶切割融合蛋白释放心钠素小肽并通过柱层析纯化蛋白质。检定产品的各项理化指标和大鼠的体内降压,体内利尿和体外舒张血管等药理活性。结果 构建了4个高效表达和心钠素融合蛋白的质粒,分别含1-4个目的基因串联操纵子;通过温度诱导表达后,该系列表达的目的分别为菌体总蛋白的46%、54.8%、56.1%和60.1%;提取纯化包涵体形式的融合蛋白后,以凝血酶切割释放心钠素,再经纯化分离出心钠素,实验室摇瓶发酵每升培养液可获3mg以上的纯度大于96%的产品,产品具有利尿,降压和舒张血管的药理活性。结论 利用融合基因的克隆与表达成功地研制了人心钠素基因工程产品。     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

GM_3促进人白血病J6-2细胞分化时蛋白激酶C活性的变化

本研究用自行提纯的GM_3观察了它对人单核样白血病细胞的促分化作用,以及促分化前后蛋白激酶C活性的影响。根据电镜观察、吞墨试验及NBT还原试验的结果,表明GM_3确能促使J6-2细胞分化;另外GM_3在促分化后,J6-2细胞的总PK-C活性下降。作者讨论了GM_3抑制蛋白激酶C的可能机理。