短发夹状RNA沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的 探讨H-ras基因对涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)生物学特性的影响以及作为SACC基因治疗靶点的可行性.方法 构建H-ras靶向H-ras-shRNA质粒及阴性对照HK-shRNA质粒,经脂质体介导转染SACC-M细胞,G418筛选建立稳定转染细胞株,将细胞分为H-ras-shRNA转染组、HK-shRNA转染组及未转染细胞组.绘制细胞生长曲线检测细胞体外增殖能力;反转录聚合酶链法分析各组细胞中H-ras基因mRNA表达变化;荧光蛋白定量分析H-ras蛋白表达水平;流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况;裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力,分析H-ras沉默对细胞增殖及凋亡的影响.结果 成功构建重组质粒并导入SACC-M细胞,建立稳定表达质粒的细胞株.H-ras-shRNA质粒能有效降低SACC-M细胞中H-ras表达,H-ras基因抑制率为61.80%,H-ras蛋白表达抑制率为62.76%.细胞增殖活性明显受抑,G0G1期比例增加;流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率为30.82%,显著高于阴性对照组及空白对照组的4.29%和4.16%.H-ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低.结论 H-ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC-M细胞中H-ras基因及蛋白水平的表达,降低细胞体内外的增殖活性,并能有效诱导细胞凋亡.     

生存素基因诱导人黏液表皮样癌细胞凋亡的实验研究

目的 研究生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞的生长抑制效应及可能的作用机制,探讨生存素基因作为黏液表皮样癌基因治疗靶点的可行性.方法 设计合成靶向生存素特异性ASODN,转染Mc3细胞.将转染的Mc3细胞分为4组:空白对照组、脂质体转染组、生存素正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)转染组、生存素ASODN转染组.转染后24、48及72 h倒置显微镜观察Mc3细胞形态学变化,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察转染前后对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法分析细胞凋亡指数,半定量反转录聚合酶链反应分别检测生存素mRNA的表达.结果 生存素ASODN转染组的Mc3细胞数量明显少于其他组,脱壁悬浮细胞明显增多,可见典型凋亡改变,并呈时间依赖性.生存素ASODN转染组Mc3细胞G1～G0期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,Mc3细胞的凋亡率在转染后24、48及72 h分别为12.96%、14.43%及22.69%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN对Mc3细胞增殖抑制率分别为22.35%、39.04%、43.46%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组在细胞转染后24、48及72 h Mc3的凋亡指数分别为11.038%、12.172%及18.900%,明显高于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.05).生存素ASODN转染组Mc3细胞生存素mRNA在24、48及72 h的相对表达量分别为0.739±0.008、0.668±0.007、0.500±0.006,相对抑制率分别为18.21%、26.06%、44.82%,明显低于其他组(P＜0.01),并呈时间依赖性(P＜0.01).结论 生存素ASODN可抑制人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3的生长增殖,诱导其凋亡,同时亦可抑制Mc3细胞生存素mRNA的表达,并呈时间依赖性.生存素可作为黏液表皮样癌基因治疗研究的一个靶点.     

Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素协同抑制鳞状细胞癌细胞增殖的研究

目的：研究bcl-xl反义寡核苷酸（ASODN）与博莱霉素（BLM）联用对口腔鳞状细胞癌细胞（Tca8113）增殖的影响及其作用机理。方法：设计合成bcl—xl的ASODN在脂质体的介导下转染Tca8113细胞,设无义寡核苷酸组（NSODN）和空白对照组进行比较。48h后博莱霉素作用于转染后的细胞。以荧光原位末端缺口标记法检测bcl-x1反义寡核苷酸与博莱霉素诱导癌细胞凋亡的作用机理,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：bcl-xl反义寡核苷酸与博莱霉素的作用机理为激活细胞的内源性核酸内切酶,使核小体内DNA断裂出现缺口,产生凋亡。ASODN组、BLM组和ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于NSODN组和空白对照组（P〈0．05）。ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于ASODN组和BLM组（P〈0．05）。结论：Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素能协同抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。     

Bcl-2与HER-2反义寡核苷酸联合转染对人舌鳞癌Tca8113细胞的干预作用

目的探讨Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸(ASODN)联合转染对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的干预作用及其分子机制。方法实验分成正常对照组、Bcl-2正义干预组、HER-2正义干预组、Bcl-2反义干预组、HER-2 反义干预组、Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸联合干预组,共6组。脂质体转染后不同时间分别进行电镜观察、 RT-PCR检测,以观察不同条件处理后各组细胞的凋亡、Bcl-2与HER-2基因表达有无差别。结果 Bcl-2与HER-2 基因反义寡核苷酸联合干预组,转染后出现凋亡小体和各期凋亡细胞;Bcl-2基因表达下降36%,HER-2基因表达下降51%。联合转染作用优于单反义基因转染作用。结论 Bcl-2与HER-2基因反义寡核苷酸联合转染能够促进肿瘤细胞凋亡并下调Bcl-2与HER-2基因的表达。     

VEGF-ASODN转染SACC-2细胞对其VEGF表达及生长的影响

目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)转染涎腺腺样囊性癌(salivany adenoidcystic cancinoma,SACC)ACC-2细胞对其VEGF表达和生长的抑制作用。方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染SACC-2细胞,24 h后原位杂交及免疫组织化学法检测细胞VEGF mRNA及蛋白表达,ELISA法检测培养液上清中VEGF蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响。结果与对照组相比,以SPSS 13.0软件进行统计学检验。结果:VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA及蛋白水平、降低培养液中VEGF蛋白含量、增加细胞凋亡、抑制细胞活性及生长。结论:VEGF-ASODN转染SACC-2细胞能显著抑制VEGFmRNA及蛋白表达、增加细胞凋亡、抑制细胞生长。     

siRNA干扰FOXM1基因对涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响

目的:探讨FOXM1对涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响。方法:以高转移腺样囊性癌细胞系(SACC-M)为对象,构建FOXM1 siRNA干扰片段,瞬转SACC-M细胞,蛋白质免疫印迹法检测干扰效率;流式细胞仪分析FOXM1干扰后SACC-M细胞周期的改变,甲基噻唑基四唑比色法检测干扰后SACC-M细胞的增殖,蛋白质免疫印迹法检测干扰后细胞周期蛋白CyclinB、CDC2的变化,划痕实验检测干扰前后细胞的迁移能力。结果:干扰后SACC-M细胞FOXM1表达明显下调,细胞增殖受到抑制,细胞周期S期比例明显下降,CyclinB表达明显下降,但细胞的迁移能力没有明显的变化。结论:FOXM1可调节涎腺腺样囊性癌细胞的增殖,但对其迁移能力没有明显作用。     

VEGF-ASODN转染对舌癌Tca8113细胞VEGF表达及生长的抑制作用

目的:研究血管内皮细胞生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)转染舌癌Tca8113细胞对其VEGF表达和生长的抑制作用.方法:人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染舌癌Tca8113细胞,24h后,应用原位杂交及免疫细胞化学法检测细胞VEGF mRNA及蛋白表达,ELISA法检测培养液上清中VEGF蛋白含量,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用MTT实验检测转染对细胞活性的影响,用细胞生长曲线表示转染对细胞生长的影响.结果与对照组比较,采用SPSS12.0软件包进行统计学分析.结果:VEGF-ASODN能显著降低VEGF mRNA及蛋白水平,降低培养液中VEGF蛋白含量,增加细胞凋亡,抑制细胞活性及生长(P<0.05).结论:VEGF-ASODN转染舌鳞癌Tca8113细胞,能显著抑制VEGF mRNA及蛋白表达,增加细胞凋亡,抑制细胞生长.     

蛋白多糖与涎腺腺样囊性癌增殖的关系

目的 探讨蛋白多糖(proteoglycans)合成的阻抑对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞增殖的影响.方法 构建靶向人木糖基转移酶-Ⅰ(xylosyltransferase-Ⅰ,XT-Ⅰ)基因的短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体shRNA-WJ3,转染人涎腺腺样囊性癌高转移株ACC-M细胞,通过G418筛选稳定转染的细胞,采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定shRNA-WJ3的基因沉默效果;检测各组细胞蛋白多糖合成分泌水平的变化.采用甲基噻唑基四唑法(MTT)检测细胞增殖情况;流式细胞术测定细胞周期改变.结果 shRNA-WJ3转染ACC-M细胞后,细胞中XT-I基因的mRNA和蛋白表达抑制率分别为83.70%和79.60%;稳定转染shRNA-WJ3的ACC-M-WJ3细胞蛋白多糖分泌显著降低(P<0.01),抑制率为49.71%～54.59%.MTT法检测结果表明:蛋白多糖合成阻抑后,ACC-M细胞增殖活性明显降低;ACC-M-WJ3细胞与对照组细胞相比:S期细胞数目减少;G_1～G_0期细胞数目增加,差异有统计学意义(P<0.01).结论 蛋白多糖合成分泌的阻抑能有效抑制ACC-M细胞的增殖.     

微小核糖核酸-21对人舌鳞状细胞癌细胞系生物学特性的影响

目的研究微小核糖核酸-21（miR-21）对人舌鳞状细胞癌细胞系生物学特性的影响。方法将2’O-Me修饰的正义和反义miR-21寡核苷酸序列通过脂质体转染技术转染到舌鳞状细胞癌细胞Tca8113及其高转移株内,采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测转染后miR-21在细胞中的表达变化,通过甲基噻唑基四唑（MTT）法、流式细胞术、Annexin Ⅴ细胞早期凋亡检测、划痕实验及Transwell实验分别检测细胞增殖能力、细胞周期、细胞早期凋亡情况、细胞迁移及侵袭能力的变化。结果靶向miR-21的反义寡核苷酸可以有效地抑制Tca8113及其高转移株细胞的增殖,促进细胞凋亡,并抑制细胞的迁移和侵袭能力。结论细胞内转染反义miR-21寡核苷酸序列后,可以降低舌鳞状细胞癌细胞中miR-21的表达,并对舌鳞状细胞癌细胞的生物学行为产生影响。     

采用RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰（RNAi）技术抑制口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3细胞凋亡抑制因子survivin基因的表达，促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA），转染对数生长期的HSC-3细胞。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达，MTT法测定细胞活性，tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡，并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组；MTT法测定细胞活性，阴性对照组和空白对照组没有明显差别，但siRNA组的细胞活性明显下降；tunnel分析显示，转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组；流式细胞术分析，转染siRNA组的凋亡率（24.99％±1.33％）明显高于阴性对照组（1.24％±0.13％）和空白对照组（0.10％±0.02％）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡，survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。