突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达

目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF-I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.方法应用PCR方法从人肝细胞cDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列,克隆入T载体pMD18中,经测序证实序列正确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性.结果经测序证实,目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增;构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实,hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中.结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I.     

人OAZ-ORF2基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

目的 克隆人鸟氨酸脱羧酶抗酶蛋白OAZ-ORF2基因,重组至真核表达载体,并在Hela细胞中表达.方法 以pET32a-OAZ质粒为模板,PCR法扩增OAZ-ORF2序列,测序鉴定后重组入真核表达载体pEGFP-N1,转染Hela细胞,表达重组蛋白.结果 PCR产物经琼脂糖电泳证实与目的基因长度一致,测序结果与GenBank公布的OAZ基因的ORF2序列一致.重组载体在Hela细胞中表达OAZ-ORF2蛋白,Western blotting分析在相对分子质量44.5×103左右出现新的蛋白条带.结论 成功构建人OAZ-ORF2基因真核表达载体,并获得表达.     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的 构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体.方法 以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞.结果 PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT.质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体.     

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的 构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白.方法 通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3.结果 经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPIC...     

新疆哈萨克族食管癌中survivin基因真核表达载体的构建

目的：探讨survivin基因真核表达载体的构建,研究它在新疆哈萨克族食管癌中的作用。方法：采用PCR方法从新疆哈萨克族食管癌的cDNA表达阳性的标本中扩增出survivin基因,经双酶切后、与真核表达载体pEGFP-N1相连后转入DH5a。结果：DNA测序证明获得了包含ORF全长的survivin基因,并成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中。结论：构建真核表达载体成功,为进一步探讨survivin基因在哈萨克族食管癌中的作用奠定了基础。     

BMP2真核表达载体的构建

目的 为研究骨缺损的基因治疗提供实验基础,构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体.方法 采用双酶切方法克隆载体将骨形态发生蛋白2基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建pcDNA3.1-BMP2表达基因载体.结果 通过测序分析证实,成功构建BMP2真核表达载体.结论 成功构建BMP2表达载体.     

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

结缔组织生长因子的克隆及其真核表达载体的构建

目的结缔组织生长因子(CTGF)在肿瘤发生,胚胎发育、骨折愈合、细胞增殖和分化、血管形成等众多领域都有着重要的作用,对结缔组织生长因子进行克隆及构建其真核表达载体,对其在功能上的进一步研究及应用有积极意义.方法以含有鼠CTGF基因序列的EST克隆为模板,通过PCR的方法克隆出目的基因CTGF,再以分子克隆学的方法将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV,进一步以PCR、酶切、DNA测序的方法筛选出正确的真核表达质粒.并通过Western-Blotting的方法对质粒的表达功能进行研究.结果 PCR、酶切、DNA测序的方法均证实已经成功克隆获得序列正确的目的基因CTGF,并将CTGF克隆入真核表达载体pAdTrack-CMV.Western-Blotting的结果表明构建的表达CTGF的真核表达载体高表达CTGF蛋白质.结论成功克隆目的基因CTGF并构建其真核表达质粒,证实在蛋白质水平获得了表达.     

钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21的构建与鉴定

目的构建钧端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达载体，寻找新的预防钧端螺旋体感染的候选疫苗。方法应用PCR技术从钧端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增LipL21基因，纯化回收后克隆入pUCm-T载体，再亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了LipL21真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的LipL21基因序列完全一致。结论成功构建了钧端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／LipL21。     

人趋化因子诱骗受体D6基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人趋化因子诱骗受体D6基因的真核表达载体。方法 PCR扩增目的基因片段,与载体分别双酶切后连接,产物转化入JM109感受态细菌,筛选阳性克隆酶切鉴定并测序。结果构建的pCDNA3.1-hD6-his真核表达载体序列正确。结论成功构建了人趋化因子诱骗受体D6的真核表达载体。     

骨桥蛋白启动子区报告基因的构建

目的 克隆和构建带人骨桥蛋白(OPN)启动子区基因的载体pGL3-OPN.方法 一步法提取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)总DNA,PCR扩增 OPN全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体pGL3-vector,酶切鉴定.将构建好的pGL3-OPN瞬时转染到人乳腺癌细胞MDA-MB-435中,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测,通过计算两种质粒荧光素酶活性的比值来筛选药物.结果 扩增出人OPN基因全长,测序结果和GenBank记载一致,成功克隆入真核表达载体.p47可一定程度激活OPN启动子活性.结论 成功构建带有人OPN基因的真核表达载体pGL3-OPN.     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

重组截短型TGF-βⅡ型受体真核载体的构建

目的构建截短型TGF-βⅡ型受体(tTβRⅡ)真核表达载体,为体外获得有活性的tTβRⅡ重组蛋白奠定基础。方法以实验室保存的含有人源tTβRⅡ基因的质粒为模板PCR扩增tTβRⅡ目的基因,利用定向克隆到毕氏酵母表达载体p PICZαA中,测序正确后,p PICZαA-t TβRⅡ载体经SaⅠ酶切线形化,以电转化法导入X-33毕氏酵母菌株中,经YPD平板Zeocin抗性筛选,通过PCR鉴定阳性菌株。结果真核表达载体pPICZαA-tTβRⅡ经酶切鉴定构建正确,测序结果显示未发生基因突变。结论成功构建pPICZαA-tTβRⅡ毕氏酵母表达载体。     

Myocardin表达载体的构建

目的 构建表达载体pEGFP-Myoc1,为转染人脐血间充质干细胞,实现其成平滑肌分化提供条件.方法 通过聚合酶链反应(PCR)以pAdApt.myoc1 为模板制备Myocardin目的 基因,通过pEGFP-N1载体线性化以及连接、转化等方法构建真核表达载体pEGFP-Myoc1,并通过酶切和测序对其序列进行鉴定.结果 正确构建了真核重组表达质粒pEGFP-Myoc1,基因测序结果表明,与Gene Bank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的真核重组表达载体pEGFP-Myoc1,为后续实验提供了基础.     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

大鼠神经球蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(neuroglobulin,NGB)基因并构建其真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确后,亚克隆入pCDNA3.1( )载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.结果 克隆了Wistar大鼠的神经球蛋白基因,有4个碱基发生了突变;成功构建了真核表达载体.结论 Wistar大鼠脑组织中有NGB表达,成功克隆了该基因并构建了其真核表达载体.