肠集聚性大肠埃希菌分离株脉冲场凝胶电泳分析

目的 对我国散发腹泻患者肠集聚性大肠埃希菌(EAEC)分离株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,以了解其分子流行病学特征并初步建立我国EAEC菌株的基础数据库。 方法 参照PulseNet大肠埃希菌O157:H7的PFGE实验方法对52株EAEC分离株进行分析,并使用BioNumerics软件进行聚类。 结果 在限制性内切酶XbaⅠ和PulseNet推荐的电泳参数下,菌株基因组酶切片段分布均匀,条带易于识别。52株EAEC分离株产生了48种PFGE带型,初步聚类为A~N 14个群,不同地区来源及不同HEp-2细胞黏附表型的菌株广泛分布在不同PFGE聚类群中。 结论 我国散发腹泻患者EAEC分离株呈现高度多态性,PFGE电泳参数和限制性内切酶XbaⅠ适用于我国EAEC菌株的分析。     

脉冲场凝胶电泳用于军团菌分型能力的评价

目的 评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术用于军团菌属不同种(Legionella species)以及不同血清型菌株的分型能力.方法 选用117株10个嗜肺军闭菌血清型,30种非嗜肺军团菌的参考菌株和我国环境分离菌株,采用Asc Ⅰ内切酶酶切,进行PFGE.从电泳条带的数量和分布、PFGE的分型力、分辨率和与流行病学资...     

上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征分析

目的 了解上海市浦东新区副溶血弧菌病原学与分子流行病学特征。 方法 运用玻片凝集法对505株副溶血弧菌菌株进行血清学分型,运用K-B纸片法对菌株进行12种抗生素药敏试验,同时对菌株基因组DNA经限制性内切酶NotⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分子分型,利用BioNumerics Version 6.64 分析软件对图谱进行聚类分析,初步建立PFGE分子分型数据库。 结果 505株菌株中有117株血清型未能分型,O3:K6为患者分离株中的优势血清型,其中69.14%(56/81)的食物中毒分离株和61.87%(185/299)的散发病例分离株血清型为O3:K6型;监测食品分离株血清型分布呈现多样性,无优势菌株。99.41%(502/505)菌株对氨苄西林耐药。505株菌株共获得221个不同的PFGE带型,有26株PFGE未能分型。监测食品分离株的PFGE呈现遗传多样性,无优势带型,并且与散发及食物中毒患者分离株的PFGE带型不同。食物中毒与散发病例分离株的优势带型相同。耐2种或以上抗生素的菌株与其他菌株的PFGE型不相同,相同PFGE带型内的菌株血清型相同,不同时间、不同腹泻监测点之间存在完全相同PFGE条带。 结论 浦东新区未出现多重耐药菌株,存在多起疑似聚集性病例事件,但与监测食品分离株的遗传谱系关系较远。     

肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳分型能力评价

目的 评价脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)技术用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的分型能力。 方法 选用220株肺炎克雷伯菌,对PFGE方法的分型力、可重复性、分辨力、流行病学一致性及其与多位点序列分型(MLST)的分型一致性进行评价。挑选全部220株菌株进行实验,评价PFGE的分型力;挑选18株菌株重复2次实验评价PFGE的可重复性;分别挑选3组无流行病关联的碳青霉烯耐药临床株、腹泻患者肠道分离株、食品分离株,使用Simpson差异指数(D)评价PFGE的分辨力;挑选同一次暴发期间分离的34株菌株,评价PFGE的流行病学一致性及其与MLST对暴发菌株分型结果的一致性;挑选64株不同来源的菌株,评价PFGE和MLST分型对流行病学不相关菌株的分型一致性。用BioNumerics软件对所有实验菌株的PFGE图谱进行分析。 结果 220株肺炎克雷伯菌中有216株通过PFGE能够获得有效的图谱,其分型力为98.18%(216/220);18株菌株重复2次实验的图谱完全一致;PFGE对无流行病关联的50株碳青霉烯耐药临床株、34株腹泻患者肠道分离株、48株食品分离株分型的D值分别为0.9910、0.9964、1.0000;针对34株暴发期间分离菌株,PFGE能够很好地甄别出暴发菌株,高度相关菌株和不相关菌株,并且分型结果与菌株分离病区、分离时间具有一致性;针对暴发菌株,PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇;针对流行病学不相关菌株,PFGE不能将相同MLST型别的菌株分成相同或相似的带型或者聚成一簇。 结论 PFGE对肺炎克雷伯菌分型具有很好的分型力、可重复性和分辨力;针对暴发菌株,PFGE能够将相同MLST型别的菌株聚成一簇;针对流行病学不相关菌株,PFGE和MLST分型一致性差。     

一起沙门菌食物中毒的实验室诊断与分析

目的 查明内蒙古某市某村发生食物中毒突发公共卫生事件的性质规模,调查可疑危险因素及其污染来源,控制疫情蔓延. 方法 制定病例定义,开展病例主动搜索,采集患者肛拭子及粪便样品、可疑食品及环境样品,进行病原菌的分离培养.分离菌株进行生化和血清学鉴定,PFGE分子分型和药敏检测. 结果 共出现43例感染病例,均参加了2014年5月6日的婚宴聚餐.19份检测样品中从7份患者肛拭子分离到肠炎沙门菌,志贺菌、致泻性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽孢杆菌检测阴性.7株肠炎沙门菌XbaⅠ酶切后的PFGE谱型完全相同,说明感染菌株来自同一个克隆,即有共同的感染源头.PulseNet China数据库比对分析显示,本次疫情菌株的PFGE图谱与我国肠炎沙门菌分离株中常见的PFGE带型JEGX01.CN0002 完全相同. 结果 此次事件为一起肠炎沙门菌引起的食物中毒,感染菌株具有国内优势的PFGE带型.     

多位点串联重复序列分析应用于中国肠炎沙门菌分型能力的评价

目的 比较脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点串联重复序列分析（MLVA）分型方法用于我国肠炎沙门菌分子分型的能力,建立我国肠炎沙门菌MLVA分型标准操作方法及数据库。方法 根据国际PulseNet公布的肠炎沙门菌PFGE和MLVA分型方案,对来自我国6个省（直辖市）的289株肠炎沙门菌进行分子分型分析,并结合流行病学资料,评价这两种分型方法对我国肠炎沙门菌分离株的分型能力。结果 289株肠炎沙门菌经XbaⅠ酶切,PFGE后获得55种带型,其分辨能力（D值）为0.8433。PFGE优势带型为JEGX01.CN0003及JEGX01.CN0001,带型频率分别为35.6%、25.6%,但二者仅表现两个条带的差异,其余型别均低于5%。采用MLVA分析,获得63种型别,分为2个群,D值为0.8608,说明MLVA分辨能力高于单酶切PFGE,但分型能力仍然有限。MLVA主要型别ST1包含了97株菌株,占37.5%,分布于各省及各年份。若联合PFGE及MLVA分型,则产生104种型别,D值为0.9058。对流行病学调查显示为肠炎沙门菌暴发病例菌株进行PFGE双酶切及MLVA分型,结果均显示这些菌株具有明显的聚集性,但不能与同期散发菌株完全区分开。结论 MLVA与PFGE分型方法的分辨能力在肠炎沙门菌中较低,在确认肠炎沙门菌引起的暴发事件时,需紧密结合流行病学调查资料,采用双酶切PFGE或MLVA进行分型分析。     

副溶血弧菌分子分型数据库建立与分析

目的 对我国8个省（直辖市）分离的副溶血弧菌使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）开展分子分型工作进行回顾性分析;建立副溶血弧菌PFGE分型数据库,分析其特征。方法 对2005-2014年期间分离自8个省（直辖市）的617株副溶血弧菌使用SfiⅠ酶切后进行PFGE实验,使用BioNumerics 5.01软件分析菌株的PFGE图谱并建立副溶血弧菌分子分型数据库。结果 本研究所建立的副溶血弧菌分子分型数据库共包含617条副溶血弧菌的分子分型信息。这些副溶血弧菌的PFGE图谱可以分为360个PFGE型别,按照PulseNet China的规则对这些PFGE型别进行编码。不同PFGE型别的相似系数介于35.8%~99.6%。237株外环境和食品分离菌株有221个PFGE型别,345株患者分离株有127个PFGE型别。相同血清型的副溶血弧菌具有相同或者非常相似的PFGE型别,而不同血清型之间的副溶血弧菌的PFGE型别差异则较大。大流行血清型（如O3:K6和O4:K8）具有多个优势PFGE型别,对于某些血清型,地理位置相近省份分离菌株的PFGE图谱相似性更高。结论 分离自患者菌株的PFGE图谱克隆化程度高,而分离自食品和外环境的菌株,PFGE图谱多态性较大。PFGE在发现病例成簇中能够发挥作用;对于患者相关PFGE图谱成簇的菌株应加强流行病学调查和溯源工作。     

环境水系分离嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳的分型研究

目的初步揭示中国环境水系嗜肺军团菌分离株的脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型特征。方法分别以SfiI和AscI为限制性内切酶,使用PFGE对菌株进行分型和聚类分析。结果单独使用SfiI、AscI和联合使用两种内切酶分别将78株嗜肺军团菌分为47、48和60个型别,分型得到的Simpson差异指数分别为0.9833、0.9817和0.9933;同一水系中分离的菌株既有带型相同或者相似者,又有带型差异较大者;相同型别的菌株可在同一水系中跨年份存在。结论PFGE对嗜肺军团菌具有很好的分辨率;多个克隆系的菌株可以在同一水系中共存,某些克隆系的菌株可以跨年份存在;环境水系中存在优势克隆系,这些优势克隆系应该在今后军团菌的监测中引起注意。     

一起GⅠ型诺如病毒混合感染多克隆蜡样芽胞杆菌致急性胃肠炎暴发事件实验室分析

  目的  通过一起急性胃肠炎暴发事件的实验室检测,分析暴发相关病原特征。  方法  对患者粪便、呕吐物标本以及可疑污染食品样本进行相关病原及毒力基因的实时荧光PCR筛查以及阳性菌的培养检测,对分离菌株进一步进行毒力基因分布分析和脉冲肠凝胶电泳分型分析。  结果  25例患者的粪便标本诺如病毒荧光PCR阳性,检出率为71.43%（25/35）,均为GⅠ型;5例患者的6份标本中蜡样芽胞杆菌荧光PCR和病原培养均为阳性,1名厨师粪便标本蜡样芽胞杆菌荧光PCR和培养结果均为阳性。 7件可疑食品样本中4件检出蜡样芽胞杆菌,其中5份食品样本ces基因阳性。 19株蜡样芽胞杆菌分离株脉冲场凝胶电泳（PFGE）分为14种带型,5例患者分离株中有2株PFGE带型相同且与厨师来源菌株分型一致,相同食品来源分离株的PFGE带型不完全一致。 19株分离株均不携带ces基因。  结论  诺如病毒和蜡样芽胞杆菌可能是导致本次急性胃肠炎暴发事件重要病原,以多病原快速筛查为指导的实验室检测对于病原的识别具有重要意义。     

肺炎克雷伯菌25株PFGE基因分型和药敏表型的比较

目的:探讨肺炎克雷伯菌耐药表型和基因组型之间的关系。方法:临床菌株用VITEK60仪器鉴定,以双纸片协同试验(DDST)筛选出产超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌(ESBLs-KP)11株和不产超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌(NESBLs-KP)14株;用XbaⅠ酶对各试验菌株进行限制性酶切,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离酶切片段,FingerprintingⅡ指纹图谱分析软件分析PFGE图谱。结果:菌株间AST结果相差较大,并可在较短时间内发生耐药变迁;筛选出产ESBLs11株,占实验菌株的44%;PFGE图谱分析,将肺炎克雷伯菌分为6群,相似性系数为52.63%～78.24%,还有1株不能分型。结论:在用于ESBLs-KP治疗时,碳青霉烯类抗生素是首选应用的抗生素;PFGE图谱分析,产ESBLs菌株和不产ESBLs分在各个群中,没有发现特异的ESBLs条带,但在同一群中,产ESBLs的菌株常为同一亚群,不产ESBLs的菌株常为另一亚群;肺炎克雷伯菌的耐药表型和PFGE的基因分型可以表现为一致,也可以表现不同。     

蜡样芽胞杆菌快速检测及其毒力基因筛选

目的筛选蜡样芽胞杆菌鉴定基因和快速检测毒力基因。方法选择分离自食品和土壤的代表性蜡样芽胞杆菌共329株,聚合酶链式反应（PCR）方法检测gyrB和groEL基因的种特异性,检测毒力基因在菌株中的分布特征。 基于检测结果,用多重PCR检测方案快速检测蜡样芽胞杆菌鉴定基因及其毒力因子。结果在蜡样芽胞杆菌及其近缘芽胞杆菌中,除1株苏云金芽胞杆菌扩增阳性外,gyrB基因具有蜡样芽胞杆菌种特异性;而groEL基因在4种芽胞杆菌中均有扩增。 6种毒力基因nheA、entFM、bceT、hblC、cytK和ces的携带率分别为84.19%、79.64%、49.24%、47.72%、47.11%和1.52%。 选择nheA、hblC、entFM、ces、cytK和gyrB用于快速鉴定蜡样芽胞杆菌及其毒力基因,获得了双重PCR扩增体系（gyrB和cytK）与4重PCR扩增体系（nheA、hblC、entFM和ces）的最佳检测方案。结论筛选的蜡样芽胞杆菌鉴定基因和毒力基因能够全面、特异、简便、高效地检测蜡样芽胞杆菌,可为食品安全检测及快速诊断提供依据,在实际检验工作中具有良好的应用前景。     

血清群6肺炎链球菌分子分型与耐药特征研究

目的 比较不同方法鉴别血清群6肺炎链球菌不同血清型的能力,了解血清群6肺炎链球菌的耐药性与分子特征。 方法 采用荚膜肿胀分型方法与聚合酶链反应(PCR)分型方法鉴别33株血清群6肺炎链球菌的血清型及相应的基因型;检测菌株对6种常用抗生素的敏感性;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法分析不同血清型菌株的基因组特征。 结果 PCR分型方法与传统的血清学分型方法结果一致。全部菌株对阿奇霉素均耐药,对利福平及左氧氟沙星均敏感;6B型菌株呈现较高的多重耐药特征。根据PFGE带型特征,所有菌株可分为2个簇,6C菌株之间、6B菌株之间带型呈现较高相似性。 结论 PCR分型方法可用于鉴别血清群6菌株的不同血清型;菌株耐药情况严重,且大多数菌株呈多重耐药特征;PFGE对鉴别肺炎链球菌不同菌株间的差异有较高的分辨率。     

Rapid identification of emetic Bacillus cereus by immunochromatography

The immunochromatographic assay, which targets a marker protein co-expressed during the synthesis of cereulide by an emetic Bacillus cereus strain, was used for easily, rapidly and specifically identifying the emetic strains among B. cereus strains from various materials associated with food poisonings. All 50 of the emetic strains showed a positive reaction to the assay, but all 50 diarrheal strains had a negative reaction. The bacterial counts of 108 cfu/ml in enrichment broth and 109 cfu/ml in food-containing enrichment were required for the identification of emetic B. cereus. The present assay could identify easily and specifically the emetic type of B. cereus within 30 min by a pure culture without special techniques and instruments.     

一起疑似食物中毒暴发事件的病原学分析

目的 阐明一起疑似由蜡样芽胞杆菌污染奶源引起的食物中毒暴发事件的病原学特征,为查明暴发源头和临床治疗提供依据.方法 对198例患儿进行流行病学调查,采集可疑奶制品和病例标本,进行菌株分离和鉴定.分离到的蜡样芽胞杆菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型、全基因组测序以及毒力基因分析.采用微量肉汤稀释法进行药物敏感性...     

Real-time PCR system targeting a chromosomal marker specific for Bacillus anthracis

Specific identification of Bacillus anthracis and differentiation from closely related Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains is still a major diagnostic problem. Commercially available diagnostic kits targeting plasmid-markers cannot differentiate between B. anthracis, non-anthracis Bacillus species harbouring anthrax-specific virulence plasmids, and plasmidless B. anthracis strains. A TaqMan PCR assay was designed targeting sequences of gene locus BA_5345 of the B. anthracis strain Ames. Specificity was determined by using a panel of 328 Bacillus strains; sensitivity was determined by probit analysis. All B. anthracis isolates (n=92) were specifically detected by using the genomic TaqMan PCR assay whereas 236 strains belonging to 19 Bacillus species other than B. anthracis were PCR negative. The detection limit was determined to be 12.7 copies per reaction (95% confidence interval 10.2-17.5 copies). Here we present an extensively evaluated and - to our current knowledge - specific TaqMan PCR assay for the detection of B. anthracis based on a chromosomal marker.     

Compact Dry(R) X-BC for the enumeration of Bacillus cereus in food samples

We evaluated the effectiveness of using Compact Dry(R) X-BC (CD-XBC), a ready-to-use and self-diffusing dry medium sheet culture system based on a novel detection principle, for the detection and enumeration of Bacillus cereus. All 13 B. cereus strains, which were studied for the inclusivity study, grew as blue/green colonies on the CD-XBC. When 3 yeast strains and 103 bacterial strains other than B. cereus were tested for the exclusivity study, 5 strains formed white colonies, and 4 strains formed blue/green colonies, while 94 other strains failed to grow. The 4 strains that formed blue/green colonies were B. thuringiensis, which is known to have the same biochemical features as B. cereus. The CD-XBC method was compared with the MYP agar method (MYP) and the NGKG agar method (NGKG) in 130 artificially contaminated food samples. The correlation coefficients between CD-XBC and MYP, and CD-XBC and NGKG were 0.972 and 0.971, respectively.     

Discrimination of the Bacillus cereus group members by pattern analysis of random amplified polymorphic DNA-PCR

We tried to discriminate 16 strains of the Bacillus cereus group including B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, and B. weihenstephanensis strains by the pattern analysis of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) -PCR. Eight oligonucleotides primers were prepared and the polymorphic patterns of the DNA of each strain were compared with those of others. The primers E and F gave different patterns of RAPD-PCR products in all strains of the B. cereus group, so these primers are effective tools for the discrimination of closely related strains. All eight primers showed different polymorphic patterns of DNA for the four strains of B. cereus isolated from the kitchen of a private home, which verifies the advantage of the RAPD-PCR analysis for the discrimination of isolated strains of B. cereus from the environment.     

37株枸橼酸杆菌的耐药性及PFGE分型分析

目的了解食品及患者来源的37株枸橼酸杆菌的耐药性、毒力基因携带及PFGE的分型情况。方法运用K-B法选择15种抗生素进行药敏试验;以PCR方法检测志贺样毒素（Istx1/I和Istx2/I）、紧密素基因（Ieae/I）及溶血素（Ihly/I）4种毒力基因;用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis,PFGE）方法进行同源性分析。结果37株枸橼酸杆菌中,25株为杨氏枸橼酸杆菌,11株为弗劳地枸橼酸杆菌,1株为布雷克氏枸橼酸杆菌。分离菌株对大多数抗生素敏感,但对头孢噻吩100%耐药。其毒力基因检测均为阴性。PFGE结果发现不同菌株带型差异较大。其中5株食品来源,1株为人来源的杨氏枸橼酸杆菌同为MAS007型,具有流行病学相关性。 结论该地区枸橼酸杆菌主要以杨氏枸橼酸杆菌为主;部分菌株具有多重耐药,应加强菌株的耐药性监测;脉冲场凝胶电泳对枸橼酸杆菌有较好的分型能力,有助于分析追踪疫情和来源;患者可能存在食源性感染,应引起疾控部门的重视。     

DnaJ sequences of Bacillus cereus strains isolated from outbreaks of hospital infection are highly similar to Bacillus anthracis

Bacillus cereus is becoming an important nomosomial pathogen because of frequent isolation from blood cultures and from severe systemic infections. To differentiate highly pathogenic outbreak strain of B. cereus from other sources of the Bacillus cereus, we attempted to analyze their dnaJ sequences. Assays indicated that dnaJ sequence similarity of all of 52 blood culture isolates of B. cereus ranged from 92.8% to 100%. The distance between B. anthracis and B. cereus except six outbreak isolates ranged from 3.8% to 6.4%. The dnaJ sequences of six outbreak strains of B. cereus (GTC 02891, GTC 02896, GTC 02916, GTC 02917, GTC 03221, and GTC 03222) were closely related to those of B. anthracis (99.2%-99.5% sequence similarity). Ba813 sequences were only found in the six outbreak strains of B. cereus. The other pathogenic factors of B. anthracis were not found in these six outbreak strains, with the exception of GTC 02891 (cap-positive). The six outbreak strains formed clear β-hemolytic colonies on a sheep blood agar plate. Our findings suggest that outbreak strains of B. cereus isolated from blood cultures are likely to have the risk of causing serious infection, and dnaJ and Ba813 are important markers to identify such strains. Phylogenetic analysis of dnaJ and MLST revealed that the six outbreak strains of B. cereus are closely related to B. anthracis.