溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的 探讨重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21(DE3)中进行原核表达的最佳条件.方法 分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET-28a(+)/CTX-M-3融合表达载体,目的 产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件.结果 表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BL21(DE3)中18℃诱导24 h,IPTG终浓度为0.8 mmol/L:表达载体在最佳条件下表达时,目的 蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33%.结论 获得pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌中表达CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础.     

牛乳铁蛋白素基因及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建牛乳铁蛋白素基因（LfcinB）及牛乳铁蛋白素突变基因（mLfcinB）的表达载体，建立在大肠埃希菌中融合表达的方法。方法依据大肠埃希菌偏爱密码子设计LfcinB和mLfcinB，进行克隆扩增并测序，构建LfcinB和mLfcinB的融合表达载体并转化人大肠埃希菌，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果成功构建了融合表达载体pGEX-4T-1-LfcinB和pGEX-4T-1-mLfcinB，表达载体转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导3h后LfcinB和mLfcinB融合蛋白表达率约为30％，洗脱纯化后产物约为60％。聚丙烯酰氨凝胶电泳显示融合蛋白为29kDa，主要以包涵体形式存在，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化后得到3．1kDa的目的蛋白。结论LfcinB及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达可提高LfcinB的表达率。     

水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达

目的:构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(leech derived tryptase inhibitor,LDTI)原核表达载体,并在大肠埃希菌[BL21(DE3)]中高效表达重组蛋白。方法:以含有目的核酸序列的质粒为模板,通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列,构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28a-LDTI重组质粒亚克隆,进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析,然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导,以Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果:成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28a-LDTI,并获得相应的融合蛋白;本实验证明,LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达,在温度为33℃,IPTG浓度为0.7 mmol,诱导时间为1 h,所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论:成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

TRAIL胞膜外段融合蛋白在大肠埃希菌内可溶性表达

目的：研究在大肠埃希菌体内可溶性表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白，为其下一步的分离纯化奠定基础。方法：依据原核表达载体pGEX-2T多克隆位点限制性内切酶要求，设计TRAIL胞膜外段PCR引物，对TRAIL的克隆载体进行PCR扩增，回收目的片段后利用DNA连接酶构建TRAIL胞膜外段原核表达载体，应用相关的生物学软件对目的蛋白的理化性质及其溶解性进行预测。酶切鉴定后将阳性重组体转入大肠埃希菌DH5α体内，分别在不同浓度异丙基硫代－β-D－半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间作用下，利用SDS－PAGE分析目的蛋白可溶性表达量。结果：PCR扩增得到TRAIL胞膜外段DNA片段，酶切结果证实已成功构建了TRAIL胞膜外段原核表达载体，预测表明95％以上的TRAIL胞膜外段融合蛋白是以可溶性的形式表达，在0.1mmol/L IPTG,20℃诱导3－4h，目的蛋白可溶性表达量达峰值，占菌体蛋白的28％。结论：本实验可在大肠埃希菌体内表达可溶性的TRAIL胞膜外段融合蛋白。     

B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化

目的: 克隆人B型钠尿肽(脑钠素,B-type natriuretic peptide,BNP)基因,纯化其表达蛋白并制备多克隆抗体。方法: 用PCR技术从正常成人心脏组织cDNA库中扩增出人BNP基因,将其克隆进pUCm-T中并测定核苷酸序列。构建大肠埃希菌分泌性表达载体pGXE4T-2/BNP,用异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,GSH-agarose亲和纯化表达蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体。结果: 经PCR扩增成功获得96bp的BNP基因,测序正确,在大肠埃希菌中融合表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的19%,用SDS-PAGE和Westernblot鉴定大肠埃希菌中的表达产物,显示其相对分子量29500。经亲和纯化后GST-BNP的纯度可以达到95%,500ml菌液中得到纯化蛋白9.6mg。多克隆抗体的效价为1:32000。结论: BNP基因的克隆、表达和纯化成功以及多抗的获得,为建立BNP检测方法奠定了基础。     

截短人胱硫醚β-合成酶的可溶性表达、纯化及活性鉴定

目的 构建截短人胱硫醚β-合成酶(T-hCBS)基因原核表达载体,得到可溶性的T-hCBS蛋白,为同型半胱氨酸检测试剂盒的开发打下基础.方法 通过优化T-hCBS基因,克隆并构建重组表达质粒pET15b/T-hCBS,转化大肠埃希菌BL21.使用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,再通过HiTrap脱盐柱脱盐,采用比色法检测目的 蛋白活性.结果 重组蛋白在大肠埃希菌中可以高效表达,产量为44 mg/L,比活约1 100 U/mg.15%SDS-PAGE 显示其相对分子质量为45 kD,与预计大小一致.表达菌体超声破碎后上清及纯化的蛋白溶液均呈现红色.结论 成功克隆和表达了T-hCBS蛋白,并得到高产高酶活性的可溶性蛋白,对同型半胱氨酸检测试剂盒的开发有一定的潜在应用价值.     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的 建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF₁₂₁)工程菌的高密度发酵工艺。方法 采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果 采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF₁₂₁的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论 该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF₁₂₁的表达水平。     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。     

基因工程菌发酵表达rhG-CSF的条件优化

目的通过优化基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）Plys表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）蛋白的发酵工艺,提高蛋白产量。方法以100 L规模发酵为例,从不同的接种量（1%～10%）、加入IPTG进行诱导时的不同OD600nm值,诱导表达后的不同溶氧可控制范围（20%～80%）等方面进行优化。用SDS-PAGE对蛋白表达量进行检测。结果优化后的方案为：采用5%的接种量,在OD600nm达到10～15时加入诱导剂IPTG,诱导起始后前20 min控制溶氧在80%以下,20 min后通过补加氨水控制pH在7.0左右,补料调节控制溶氧在20%～40%的范围内,诱导表达5 h后收集菌体。优化后的发酵方案极大提高了蛋白表达量。结论 rhG-CSF蛋白发酵方案的优化对大规模生产具有重要的指导意义。     

人可溶性TRAIL蛋白表达及纯化条件优化

目的：优化人可溶性TRAIL蛋白生产菌发酵及纯化条件,从而提高TRAIL的产量及活性。方法①探索6种不同培养液、培养液pH值、异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导浓度及时间,选择最佳发酵条件;②联合镍离子亲和层析及超滤法纯化人可溶性TRAIL蛋白。结果①人可溶性TRAIL的最佳发酵条件为pH7．4的YPD培养液,所用IPTG的最佳浓度为0．2 mmol/L,最佳诱导时间为6 h;②经镍离子亲和层析和超滤联合作用可得纯度极高的蛋白。结论成功完成了人可溶性TRAIL发酵及纯化条件的优化,为今后大量提取TRAIL蛋白奠定了基础。     

原发性胆汁性肝硬化患者自身抗体谱检测分析

目的：对确诊PBC患者自身抗体AMA/AMA-M2、ANA进行分析,为临床诊断提供实验室参考.方法：间接免疫荧光法检测55例确诊PBC患者与71例AIH患者血清ANA、AMA/AMA-M2等抗体.结果：55例PBC患者中AMA检出率为80％（44/55）,AMA-M2检出率为58.1％（32/55）,37例ANA阳性,检出率67.3％,其中11例（20％）均质型,7例（12.7％）为着丝点型,6例（10.9％）核膜型,5例（9.1％）为颗粒型,3例（5.5％）为核点型,6例（10.9％）为混合型;而71例AIH患者中AMA检出率为14.1％ （10/71）,AMA-M2检出率为2.8％（2/71）,40例ANA阳性,检出率56.3％,其中4例（5.6％）均质型,3例（4.2％）为着丝点型,7例（9.9％）核膜型,9例（12.7％）为颗粒型,7例（9.9％）为核点型,10例（14.1％）为混合型.结论：PBC患者AMA的检出率明显高于其他自身抗体指标,且AMA-M2仅见于PBC患者与AIH＋ PBC重叠综合征的患者;ANA在PBC患者中的检出率仅次于AMA,但是不能单独用于PBC的诊断.     

原发性胆汁性肝硬化36例临床和免疫学特征

目的:分析原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的临床特征及免疫学特征。方法:回顾性分析我院2007年8月~2010年7月收治的36例PBC患者的临床资料。结果:36例PBC患者中黄疸33例(91.7%)、皮肤瘙痒27例(75.0%)、腹水22例(61.1%)。血生化指标:总胆红素(149.2±65.6)μmol/L、碱性磷酸酶(298.6±128.1)U/L,γ-谷氨酰转肽酶(172.6±84.9)U/L;免疫学指标:IgM(4.98±3.1)g/L,抗线粒体抗体AMA-M2阳性30例(83.3%),GP210阳性5例(13.9%),SP100阳性2例(5.6%)。肝肾微粒体LKM-1阳性2例(5.6%)肝细胞溶质抗原Ⅰ型(LC-1)抗体(2.8%),抗核抗体(ANA)5例(13.9%)。36例患者经熊去氧胆酸等治疗,31例病情好转,有效率达86.1%。结论:PBC以中年女性多见,黄疸、皮肤瘙痒为患者最主要表现,AMA-M2、GP210、SP100等自身抗体检测是诊断P B C的重要依据之一,熊去氧胆酸治疗效果确切。     

白花丹素通过调节线粒体相关旁路蛋白及细胞周期促进非小细胞肺癌H23细胞的凋亡

目的研究天然小分子复合物白花丹素对人类非小细胞癌H23细胞的凋亡作用及其内在机制。方法应用不同浓度梯度的白花丹素(0.5~200μmol/L)培养H23细胞24 h,水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测H23细胞增殖活力,双染流式细胞仪检测凋亡细胞及细胞周期,计算药物半数抑制浓度(IC50),CM-H2DCFDA探针检测细胞内活性氧化物(ROS),聚丙烯凝胶电泳法检测线粒体旁路相关蛋白。结果白花丹素对于H23细胞系具有极高的抑制增殖的效应,IC50为7.80μmol/L。该抑制增殖效应与G2/M细胞周期停滞,ROS和凋亡相关细胞死亡有关。白花丹素造成细胞周期G2/M的比例上升,并增加ROS的水平。在H23细胞系中,白花丹素增加细胞色素C(Cytochrome C)的表达,促凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)、半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)的活化,而降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论白花丹素导致H23细胞G2/M周期停滞,并通过线粒体相关旁路诱导人类非小细胞肺癌H23细胞系的凋亡。     

自身抗体谱在原发性胆汁性肝硬化诊断中的作用

目的分析原发性胆汁化肝硬化（PBC）患者的自身抗体谱和免疫功能,探讨其对PBC的诊断价值。方法用免疫印迹法检测107例PBC、100例疾病对照组和30例健康体检者血清中的抗线粒体抗体（AMA）M2亚型、AMAM2—3E（BPO）、抗Spl00抗体、抗gp210抗体、抗肝肾微粒体1型（LKM一1）抗体、抗早幼粒细胞性白血病（PML）抗体、抗肝特异性胞质抗体-1（LC-1）、抗可溶性肝抗原,肝胰抗原抗体（SLA／LP）。结果1．AMA—M2、AMAM2—3E（BPO）、抗Spl00抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体对PBC诊断的敏感性、特异性分别为74．7％、90．2％,86．9％、95．1％,32．7％、97．1％。27．1％、97．5％,39．3％,98．3％。未检测到抗LKM-1抗体、抗LC～1抗体、抗SLA几P抗体。2．在118例疾病对照组中AMA—M2、AMAM2—3E（BPO）、抗Sp100抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体检出率分别为16％、11％、3％、1％、3％,未检测到抗LKM-1抗体、抗LC-1抗体、抗SLA／LP抗体。在正常对照组上述8种抗体的检出率均为0。3．AMA—M2呈阳性的患者（n=97）比呈阴性的患者（n=lO）有更加严重的疾病。这可通过更加严重的组织学变化和更高的IgG,IgM和ALP平均值看出;抗gp210抗体呈阳性的患者肝功能衰竭发生率明显高于呈阴性的患者（P〈0．05）。结论PBC患者血清中可检测到多种自身抗体,其中抗Spl00抗体、抗PML抗体、抗gp210抗体在PBC诊断中特异性高,可协助诊断PBC。     

小檗碱对体外血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的:观察小檗碱对体外血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和凋亡的影响。方法:培养兔主动脉平滑肌细胞至8～10代,根据小檗碱作用时间不同分成24h、72h组,每一时间组据小檗碱浓度不同分为5组:0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L组。用台盼蓝活细胞计数法和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察药物对VSMCs增殖的影响。用Boyden小室法检测穿膜细胞数,观察小檗碱对VSMCs迁移的影响。用TUNEL法及流式细胞仪检测小檗碱对VSMCs凋亡的影响。结果:台盼蓝活细胞计数显示小檗碱作用24h、72h后,随小檗碱浓度增加,活细胞数减少(P<0.05)。MTT法检测显示小檗碱作用24h、72h后,随小檗碱浓度增加,生长抑制率增高,随小檗碱干预时间延长,细胞生长抑制率增加(P<0.01)。Boyden小室法检测显示随小檗碱浓度增加,穿膜细胞数减少(P<0.05)。TUNEL检测显示各组施加干预48h后,对照组和各实验组的凋亡阳性率分别为13.15%、12.04%、10.62%、9.73%和9.72%(P>0.05)。流式细胞仪检测小檗碱作用48h后,对照组、50μmol/L和100μmol/L浓度小檗碱组的细胞凋亡率分别为20.4%、18.7%和17.2%。结论:小檗碱对VSMCs的增殖和迁移有显著抑制作用,而小檗碱对VSMCs的凋亡无促进作用。     

天晴甘美对人急性淋巴细胞白血病Molt4细胞系增殖的抑制作用

目的观察天晴甘美对人急性淋巴细胞白血病Molt4细胞系增殖的抑制作用。方法将天晴甘美（粉末）以1640培养液倍比稀释成10g/L、1g/L、10-1g/L、10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L、10-5g/L、10-6g/L共8个浓度组,分别处理增殖期人急性淋巴细胞白血病Molt4细胞,镜下观察不同时间点细胞生长情况,应用CCK-8法检测细胞增殖能力,绘制生长曲线,计算抑制率和半数抑制浓度（IC50）。结果给药第3天,〉10-3g/L浓度时抑制作用显著（P〈0.05）,10g/L、1g/L、10-1g/L、10-2g/L和10-3g/L的抑制率分别为87.1%、64.6%、48.7%、47.5%和31.7%,IC50约为0.013g/L。结论天晴甘美对Molt4细胞具有抑制作用。     

熊去氧胆酸联合非诺贝特治疗胆汁性肝硬化的疗效观察

目的：评价熊去氧胆酸（UDCA）联合非诺贝特对UDCA反应不佳的胆汁性肝硬化（PBC）患者的疗效。方法选择熊去氧胆酸治疗1年疗效不佳的PBC患者14例,给予UDCA 15 mg/（kg＆#183;d）,加非诺贝特0.16 g口服,治疗3个月。观察治疗前后患者症状、体征和肝功能生化指标的变化。结果治疗3个月后,71.4%（10/14）的PBC患者乏力症状明显减轻,57.1%（8/14）的患者皮肤瘙痒缓解,85.7%（12/14）的患者腹胀减轻,71.4%（10/14）的患者尿色变浅。治疗后较治疗前总胆红素[（43.1±19.6）μmol/L vs.（65.3±21.5）μmol/L]、直接胆红素[（38.3±11.0）μmol/L vs.（49.6±15.3）μmol/L]、总胆固醇[（5.36±1.82）mmol/L vs.（8.63±1.58）mmol/L]、γ-谷氨酰转肽酶[（155.6±86.3）U/L vs.（421.3±123.4） U/L]、碱性磷酸酶[（196.2±101.5）U/L vs.（395.1±156.3）U/L]、丙氨酸氨基转移酶[（42.5±18.9）U/L vs.（58.3±23.8）U/L]、天冬氨酸氨基转移酶[（40.3±25.6）U/L vs.（53.3±23.7）U/L]明显下降（P均〈0.05）;胆碱酯酶及白蛋白较前有上升,但差异无统计学意义（P 〉0.05）。结论对UDCA疗效不佳的PBC患者,UDCA联合非诺贝特可能有效改善患者的症状、体征及肝功能生化指标。