DJ-1 shRNA靶向逆转人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性

目的探讨干扰癌基因DJ-1表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM多药耐药性(multi-drug resistence,MDR)的影响。方法将构建的DJ-1 shRNA真核表达载体,用脂质体转染至人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM;用RT-PCR和Western blot法分别检测细胞MDR 1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)的表达;MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性。结果 DJ-1 shRNA靶向干预MCF-7/ADM细胞DJ-1表达后,DJ-1 shRNA组细胞MDR 1 mRNA和P-gp表达水平较空白与阴性对照组明显下降(P0.0 1);细胞内Adriamycin浓度明显增加;细胞对Adriamycin的敏感性增强2.6 8倍。结论 DJ-1shRNA可降低乳腺癌MCF-7/ADM细胞的MDR,为研究逆转乳腺癌化疗耐药提供了新方法。     

MDR1 siRNA对胰腺癌细胞株BxPC-3耐药性影响的实验研究

目的：观察阻断多药耐药基因1（MDR1）表达后胰腺癌细胞对化疗药物敏感性的变化,探索提高胰腺癌化疗疗效的新方法。方法：采用RNA干扰技术．构建MDR1 siRNA重组质粒．脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,并筛选稳定转染细胞克隆,RT-PCR和Western印迹法检测MDR1 mRNA和蛋白的表达变化。将细胞接种于裸鼠,观察移植瘤对化疗药物吉西他滨敏感性的变化。结果：转染MDR1 siRNA质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MDR1 mRNA与蛋白表达水平明显降低。体内实验结果显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤对化疗药物吉西他滨更为敏感（P〈0．05）。结论：通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MDR1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能提高细胞对化疗药物的敏感性。     

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的 检测小干扰RNA(siRNA)对肝癌耐药细胞株HepG2/阿霉素(ADM)多药耐药相关蛋白基因2(MRP2)及其蛋白产物的抑制作用,观察对多药耐药性的影响.方法 使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株(HepG2/ADM),ADM浓度从0.1～2.0 m/L:设计合成针对MRP2的siRNA小片段,转染HepG2/ADM耐药细胞,24 h后通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果;噻唑蓝(MTT)比色法观察抑制MRP2基因表达后,HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性变化,并计算各药物的半数抑制浓度(IC50).结果 HepG2/ADM对ADM、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0.3204、3.8002、0.2014和0.1221;siRNA明显抑制了HepG2/ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);转染MRP2-siRNA后,HepG2/ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小,分别为0.1023、1.4417、0.0452和0.0268.结论 用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2/ADM细胞对化疗药物的耐药性,MRP2基因与HepG2/ADM肝癌细胞的多药耐药性相关,可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性.     

中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素(ADM)诱导的HepG2/ADM细胞的多药耐药性的机制。方法以亲本细胞HepG2为对照,MTT法观察肝癌-1号对HepG2/ADM细胞的毒性作用;流式细胞仪检测肝癌-1号作用后细胞表面p-糖蛋白(P-gp)表达阳性率;逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因(MDR1)mRNA表达水平;MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2/ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果肝癌-1号<50μmol/L对HepG2/ADM细胞无明显毒性,半数抑制率(IC50)为75μmol/L;50μmol/L的肝癌-1号可部分抑制HepG2/ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达,可逆转HepG2/ADM的耐药性,对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3.94(P<0.01),1.72(P<0.05),1.67(P<0.05)。结论肝癌-1号通过抑制HepG2/ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成,能部分逆转HepG2/ADM的耐药性。     

中药复方肝癌-1号逆转肝癌多药耐药的实验研究

目的 分析中药复方肝癌-1号逆转阿霉素（ADM）诱导的HepG2／ADM细胞的多药耐药性的机制。方法 以亲本细胞HepG2为对照，MTT法观察肝癌-1号对HepG2／ADM细胞的毒性作用；流式细胞仪检测肝癌1号作用后细胞表面p-糖蛋白（P-gp）表达阳性率；逆转录聚合酶链式反应检查多药耐药基因（MDR1）mRNA表达水平；MTT法观察肝癌-1号处理后的HepG2／ADM细胞对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶耐药的逆转作用。结果 肝癌-1号〈50μmol／L对HepG2／ADM细胞无明显毒性，半数抑制率（IC50）为75μmol／L；50μmol／L的肝癌-1号可部分抑制HepG2／ADM细胞P-gp合成及MDR1 mRNA的表达，可逆转HepG2／ADM的耐药性，对阿霉素、表阿霉素、氟尿嘧啶的逆转倍数分别为3．94（P〈0．01），1．72（P〈0．05），1．67（P〈0．05）。结论 肝癌-1号通过抑制HepG2／ADM耐药细胞MDR1 mRNA的表达及P-gp合成，能部分逆转HepG2／ADM的耐药性。     

维拉帕米逆转胰腺癌化疗耐药的研究

目的　探讨多药耐药蛋白P 170拮抗剂维拉帕米对胰腺癌细胞株化疗耐药的逆转作用。方法　采用RT PCR法对胰腺癌细胞株SW 1990和CAPAN 1中多药耐药基因MDR1mRNA的表达进行半定量分析 ;罗丹明外排试验检测胰腺癌细胞株中P 170的功能 ;MTT比色法评估胰腺癌细胞株对化疗药物的敏感性 ,并比较单纯化疗与化疗联合维拉帕米对其的疗效差异。结果　RT PCR检测结果显示MDR1mRNA在SW 1990中的表达丰度为 0 5 75 0± 0 0 76 4 ,在CAPAN 1中的表达丰度为 0 186 4± 0 0 5 36 ,两者具有显著差异 (P <0 0 1)。罗丹明外排试验表明 :SW1990阳性细胞百分数明显低于CAPAN 1(P <0 0 1) ;维拉帕米可使SW 1990阳性细胞百分数明显增加 (P <0 0 1)。MTT结果表明 :SW1990较CAPAN 1对ADM、MMC耐药 ;维拉帕米可部分逆转其对ADM和MMC的耐药性。结论　MDR1可能参与胰腺癌细胞株化疗耐药 ;中等剂量的维拉帕米联合化疗可逆转具有MDR1表型的人胰腺癌细胞株对ADM和MMC的耐药现象。     

肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药模型的建立及其耐药机制

目的 建立肝细胞癌SMC7721体内外多药耐药细胞株并探讨其耐药机制.方法 通过阿霉素浓度递增筛选出SMC7721/ADM肝癌多药耐药细胞株并建立裸鼠移植瘤模型;噻唑蓝(MTr)检测各组移植瘤对化疗药物的耐药性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MDR1和BCRP在各组移植瘤中的表达.结果 SMC7721/ADM对阿霉素,丝裂霉素,5-Fu的耐药性均较亲本细胞明显降低(P<0.01);其移植瘤对3种化疗药物的IC50.均明显低于亲本细胞(P<0.05);SMC7721/ADM细胞中MDR1 mRNA表达是亲本细胞的40.13倍(P<0.01);BCRP mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05).其移植瘤中BCRP mRNA表达是亲本细胞移植瘤的3.69倍(P<0.01);而MDR1 mRNA表达与亲本细胞差异无统计学意义(P>0.05);SMC7721/ADM细胞株中两种蛋白表达显著高于亲本细胞株(P<0.01);SMC7721/ADM移植瘤中BCRP蛋白表达显著高于亲本移植瘤(P<0.01),而两者中MDR1表达差异无统计学意义(JP>0.05).结论 MDR1和BCRP在SMC7721/ADM多药耐药的不同阶段起作用并介导肝细胞癌对不同药物的耐药性.     

短发夹RNA干扰表达质粒逆转人大肠癌细胞LOVO／5-Fu多药耐药的研究

目的：探讨短发夹RNA（shRNA）沉默多药耐药MDR）基因对大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人大肠癌多药耐药细胞株LO-VO/5-Fu,MTT法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白（P-gp）的表达,Realtime-PCR检测各组细胞MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化。结果：与对照组质粒组和未转染组相比,转染含shRNA干扰质粒细胞的实验组IC50明显降低,为（2.304±0.232）μmol/L,且差异有统计学意义（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为73.8%;凋亡率明显升高为（5.767±0.694）%（P〈0.05）;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）。结论：靶向MDR1的shRNA干扰质粒有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,从而增强了LOVO/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,有可能为临床上克服大肠癌化疗过程中出现的耐药提供新的作用靶点和治疗途径。     

靶向Bel-7402/ADM细胞MDR1基因高效siRNA的构建与鉴定

目的 构建并鉴定靶向人肝癌多药耐药细胞亚系Bel-7402/ADM细胞MDR1基因的高效siRNA,为逆转肝癌多药耐药提供新的分子靶点.方法 设计并化学合成4条靶向MDR1的siRNAs(mdrlsi-1、mdrlsi-2、mdrlsi-3和mdrlsi-4),通过LipofectamineTM2000介导转染Bel-7402/ADM细胞株,用RT-PCR检测Bel-7402/ADM细胞MDRlmRNA表达、western blot检测P-gp的表达,综合评价这4条siRNAs的沉默效果.结果 经siRNA干扰后,4条siRNAs均能不同程度逆转Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的多药耐药,mdrlsi-1组mRNA和蛋白表达与其他组比较有显著性差异(P＜0.05).结论 相比较其他3条siRNAs,mdrl si-1对人肝癌Bel-7402/ADM细胞MDR1介导的耐药逆转效果最好,其靶序列有望成为逆转肝癌多药耐药新的靶点.     

多药耐药相关基因及其蛋白在介导胰腺癌细胞原发性耐药中的作用及调控

目的 检测多药耐药相关基因（MDR1）及其蛋白（P-gP）在胰腺癌细胞株的表达,初步探讨胰腺癌发生先天性耐药的机理。方法 选择8株人胰腺癌细胞株,采用RT-PCR方法检测MDR1mRNA在胰腺癌细胞中的表达;通过免疫细胞化学方法检测P-gP的表达;以流式细胞仪检测胰腺癌细胞对罗丹明的外排情况,评价P-gP泵功能;最后通过P-gP抑制物维拉帕米与化疗药物联合应用,检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MDR1mRNA在胰腺癌细胞株SW1990中的表达最高,除PCT-2未检测到MDR1的表达外,其余6株细胞均有MDR1的微弱表达;免疫细胞化学染色结果证实P-gP在SW1990中的表达明显高于其他细胞株。57．9％±5．4％的SW1990细胞内有罗丹明蓄积,而在P-gP阴性对照细胞中,99．5％±3．3％的细胞内存在罗丹明的积聚,两者差异有统计学意义（P〈0．05）。P-gP抑制物维拉帕米与阿霉素或表阿霉素联合应用时可以部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。结论 MDR1及P-gP在人胰腺癌细胞中存在一定量的表达;维拉帕米联合阿霉素可以明显抑制P-gP阳性细胞的生长。     

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1与胰腺癌细胞获得性耐药的关系

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸酶1（MKP-1）在介导胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu产生获得性耐药过程中的可能机制。方法 采用Northern印迹杂交和Western蛋白免疫印迹杂交方法,检测MKP-1在体外诱导建立的人胰腺癌耐药细胞株SWl990／Fu、亲本细胞株SWl990和胰腺癌细胞株MiaPaCa-2中的表达,分析MKP-1在SW1990／Fu产生获得性耐药前后的变化。结果 Northern印迹杂交结果显示,在SWl990／Fu、SWl990和MiaPaCa~细胞株中均检测到2400bp的MKP-1mRNA,MKP-1在SWl990／Fu的表达水平明显低于SWl990和MiaPaCa-2。在蛋白水平上,Western蛋白免疫印迹杂交结果也表明,与SWl990和MiaPaCa4相比,MKP-1蛋白在SWl990／Fu细胞中的表达水平明显降低。结论 MAPK家族的关键调节酶MKP-1可能参与SWl990／Fu获得性耐药的产生,推测细胞信号转导系统的改变可能是导致胰腺癌细胞产生获得性耐药的机制之一。     

VEGF siRNA及bFGF siRNA对胰腺癌细胞增殖和侵袭性的影响

目的 探讨胰腺癌细胞中VEGF及bFGF的表达水平与其恶性生物学行为的关系.方法 将胰腺癌细胞株SW1990、Panc-1及PCT-3分别分为4组:对照组、VEGF siRNA处理组、bFGF siRNA处理组和VEGF siRNA+bFGF siRNA处理组.通过CCK-8法及Boyden Chamber趋化小室检测不同处理对3株细胞侵袭性及增殖能力的影响.结果 VEGF siRNA和bFGF siRNA能显著抑制3 株胰腺癌细胞中VEGF及bFGF的表达.CCK-8法检测结果显示:除PCT-3细胞外,其他两株细胞各处理组肿瘤细胞的增殖能力均弱于对照组(P＜0.05).Boyden Chamber趋化小室检测结果显示:3 株胰腺癌细胞各处理组与对照组比较,侵袭性的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 通过下调VEGF及bFGF的表达水平可抑制胰腺癌细胞的增殖与侵袭能力.     

长链非编码RNA XIST在胰腺癌中的表达及意义

目的:探讨长链非编码RNAXIST在胰腺癌组织中的表达及其作用。方法:实时定量PCR检测56对胰腺癌及癌旁正常胰腺组织标本中XIST的表达,以及XIST在人胰腺导管上皮细胞(HPDE)及7种胰腺癌细胞系(sPC-3、Bx PC-3、Capan-1、CFPAC-1、Hs766T、Panc-1、SW1990)中的表达,分析XIST表达与胰腺癌患者临床病理因素的关系;在XISTsi RNA干扰XIST高表达的胰腺癌细胞后,分别用MTT法和Brd U实验检测细胞的活力和增殖情况,Westernblot检测细胞中Ki-67、PCNA的蛋白的表达。结果:胰腺癌组织中XIST的表达量明显高于癌旁正常胰腺组织(2.452vs.0.9729,P0.001),且XIST高表达与胰腺癌患者的肿瘤分期(P=0.016)、淋巴结转移(P=0.032)有关。7种胰腺癌细胞系中XIST的表达量均明显高于HPDE细胞(均P0.05),其中SW1990细胞XIST表达量约为HPDE细胞的2.5倍。XISTsi RNA干扰SW1990细胞48h后,与未处理的SW1990细胞比较,细胞的活力(0.812vs.1.215)和增殖能力(0.708vs.1.007)均明显降低,Ki-67(0.467vs.1.027)与PCNA(0.600vs.0.997)的表达均明显下调(均P0.05)。结论:XIST在胰腺癌组织中表达升高,其高表达能促进胰腺癌细胞的生长,机制可能与其上调Ki-67、PCNA表达有关。     

胰腺癌细胞株耐药与凋亡相关基因的改变

目的探讨凋亡相关基因的改变与胰腺癌细胞耐药的关系。方法利用含有18000条人类基因的cDNA基因芯片对人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的差异表达基因进行筛选。结果人胰腺癌细胞株SW1990与耐药细胞亚株SW1990/FU和SW1990/ADM间的共同差异表达基因有170条,其中6条与细胞凋亡相关。结论凋亡相关基因hSiah2、TIA1、CDC2、PDCD2、MAPK6及MAP4K3可能参与了胰腺癌耐药过程的发生,可能成为新的胰腺癌耐药相关基因。     

吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究

目的 建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ,并探讨SW1990/GZ和胰腺癌肿瘤干细胞的相关性.方法 应用间歇浓度梯度倍增法建立吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株SW1990/GZ;倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法计算耐药指数(RI);荧光定量PCR检测ABCB1、ABCC1及ABCG2基因的表达水平;裸鼠皮下种植瘤试验观察SW1990和SW1990/GZ的成瘤能力;流式细胞仪通过侧群细胞(SP)法和表面特异抗原标记法(CIM4+CD24+)检测肿瘤干细胞含量.结果 在形态学上,SW1990/GZ较SW1990发生明显改变;SW1990/GZ的耐药指数是亲代SW1990的77.2倍;与亲代SW1990相比,耐药株SW1990/GZ中ABCB1、ABCC1及ABCG2的表达水平明显增高(P<0.01),裸鼠皮下成瘤能力增强(P<0.01);耐药株SW1990/GZ中SP细胞比例为(11.0±1.0)%,亲代SW1990中SP细胞比例为(4.6±0.9)%,CD44+CD24+细胞在两者中的比例分别为(8.7±0.8)%和(1.1±0.4)%(P<0.01).结论 吉西他滨耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ能高效富集胰腺癌肿瘤干细胞,CD44与胰腺癌获得性耐药关系密切,可能为克服胰腺癌获得性耐药提供新的治疗靶点.     

MBD1 RNA干扰对胰腺癌细胞株BxPC-3生长影响的实验研究

目的 观察阻断MBD1表达后对胰腺癌细胞生长增殖的影响,探讨MBD1在胰腺癌发生发展中的作用.方法 采用RNA干扰技术,构建MBD1-siRNA重组质粒,脂质体介导转染人胰腺癌细胞株BxPC-3,RT-PCR和Western印迹检测转染前后MBD1 mRNA与蛋白的表达变化,MTT法检测转染前后BxPC-3细胞的生长曲线,将细胞接种于裸鼠,观察转染前后胰腺癌细胞体内移植瘤的生长情况.结果 转染siRNA-MBD1质粒后胰腺癌细胞株BxPC-3 MBD1的mRNA与蛋白表达水平明显降低.MTT法检测细胞的生长曲线,发现转染组较转染空质粒组和未转染组生长明显缓慢(P<0.01);体内实验显示,将转染前后的细胞接种于裸鼠,转染组移植瘤生长速度明显较其他两组减慢(P<0.01),RT-PCR检测移植瘤MBD1mRNA表达的变化,转染组中未能测到明显的MBD1表达.而转染组中CDH1、Rb等抑癌基因mRNA的表达明显高于转染空质粒组和未转染组.结论 通过RNA干扰技术,可在转录和翻译水平降低MBD1在胰腺癌细胞株BxPC-3中的表达,并能抑制肿瘤细胞的生长,但其作用机制尚不清楚,MBD1介导的转录抑制作用可能在胰腺癌的发生发展过程中起到重要的作用.