超声破坏微泡造影剂促进大鼠心肌血管新生的实验研究

目的探讨超声破坏微泡刺激大鼠心肌内源性VEGF分泌、促进血管生成的新途径。方法正常成年Wistar大鼠30只随机分为3组。第1组超声破坏微泡组，第2组单纯超声辐照组，第3组对照组。每组均进行3次处理。第一次处理3d后每组各取1只大鼠断颈处死后取其心肌，常规HE染色光镜观察心肌结构变化。剩余大鼠于2周后取材，免疫组化检测心肌组织中VEGF表达，CD34免疫组化检测评定超声破坏微泡促进心肌血管新生疗效。结果超声破坏微泡组心肌组织中见大量VEGF和CD34表达，新生血管较多。单纯超声组心肌组织中有较少VEGF和CD34表达，新生血管较少。对照组仅有极少量VEGF和CD34表达，未见明显新生血管。结论超声破坏微泡可刺激心肌内源性VEGF分泌，促进血管新生。     

超声微泡造影剂与血管新生

随着对超声微泡造影剂研究的不断深入,人们发现微泡受一定强度超声辐照后会破裂并产生空化效应,从而使局部毛细血管破裂,血管内容物外渗并在局部引起炎症反应,其产生的炎症因子可促进局部组织血管新生,据此可以用来治疗一些缺血性疾病。本文就超声微泡造影剂促进血管新生之机制和应用前景作一综述。     

超声破坏微泡促进骨骼肌血管新生的时间-效应关系研究

目的 探讨超声破坏微泡促进大鼠骨骼肌血管新生的时间-效应关系.方法 将48只SD大鼠随机分为4组(超声破坏微泡组、单纯超声组、单纯微泡组、对照组),超声破坏微泡组经尾静脉输入自制的脂质全氟丙烷微泡造影剂0.5 ml,同时用1.0 MHz、2.0 W/cm2的超声在其大腿骨骼肌局部作用3min;单纯超声组仅在骨骼肌局部用同等的超声能量作用;单纯微泡组仅由尾静脉输入脂质全氟丙烷微泡造影剂0.5 ml;对照组不作任何处理.实验结束后的第3、7、10、14、21、28 d,各组分别取两只大鼠处死,取局部骨骼肌行石蜡切片HE染色观察显微结构的变化,CD34免疫组化计数微血管密度(MVD),酶联免疫吸附试验(ELISA)定量评价血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 超声破微泡组有较多的血管新生;单纯超声组新生血管较少;单纯微泡组和对照组几乎无血管新生.随着时间的变化,超声破坏微泡组的MVD值和VEGF表达在第10 d达到高峰;单纯超声组的高峰出现在第14 d.结论 超声破坏微泡可刺激骨骼肌中内源性VEGF较快、较多地分泌,从而更好地促进新生血管生成.     

超声靶向破坏微泡介导骨髓间充质干细胞移植促进大鼠血管新生

目的 探讨超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞(MSCs)移植在大鼠缺血骨骼肌中的作用. 方法 24只Wister大鼠离断右侧股动脉7 d后分为4组:①超声+微泡组(US+MB);②干细胞静脉移植组(MSCs-iv);③超声+微泡+干细胞静脉移植组(US+MB+MSCs-iv);④对照组.处理后第7 d取局部缺血骨骼肌行免疫组化检测. 结果 US+MB+MSCs-iv组缺血骨骼肌可见较多移植的MSCs,其新生血管数量较其他组明显增加. 结论 超声靶向破坏微泡有可能成为一种增强MSCs移植和促进血管新生的新方法 .     

诊断超声加微泡造影剂对新生血管的作用

目的评价诊断超声加微泡造影剂对兔VX2肝肿瘤新生血管的作用.方法用二维灰阶超声监测6只大白兔肿瘤生长情况,待肿瘤长至长径约0.6～1.0 cm时进行实验.实验分为两组,处理组注射微泡造影剂(全氟显),对照组注射相同剂量的生理盐水.先用二维超声定位肿瘤,然后对处理组大白兔通过兔耳缘静脉缓慢注射微泡造影剂,剂量为0.10 ml/kg,注射时间约5 s.注射的同时行持续性二维超声显像(将MI调至1.4).整个显像过程持续6～7 min.然后两组肝肿瘤取材后送做透射电镜及切片HE染色检查.结果超声微泡造影剂能够显著增强肿瘤显像,同时也存在对肿瘤血管明显的生物学效应.在光镜下未见明显的肿瘤血管损坏,未见红细胞渗出等改变,但在电镜下可见肿瘤新生毛细血管明显的超微结构破坏,包括线粒体肿涨、髓样变及胞质空化等改变.结论高机械指数诊断超声加超声微泡造影剂能够破坏肿瘤新生血管的超微结构.     

超声破坏微泡造影剂促进心肌梗死大鼠血管新生的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡造影剂刺激大鼠心肌血管内皮生长因子(VEGF)分泌、促进新血管生成的作用.方法 建立大鼠心肌梗死模型,随机分为4组.A组行超声破坏微泡治疗,B组行单纯超声治疗,C组单纯注射微泡,D组注射生理盐水作为对照,每组均处理3次.4周后取材,免疫组化检测心肌组织中VEGF、CD34表达,ELISA及Western blot检测VEGF表达.结果 A组心肌组织中见大量VEGF和CD34表达,新生血管较多;B组有较少VEGF和CD34表达,新生血管较少;C组和D组仅有极少量VEGF和CD34表达,未见明显新生血管.ELISA检测显示,A组VEGF表达量明显增高[(8.194±1.129)Pg/g],与其他三组[B组(4.339±0.753)Pg/g,C组(2.304±0.762)Pg/g,D组(2.411士0.801)Pg/g]比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测显示A组有一条约21 kD的明显的蛋白质条带表达.结论 超声破坏微泡可刺激心肌内源性 VEGF 分泌,促进血管新生.     

超声靶向破坏阳离子微泡介导SDF-1α基因转染提高外源性血管新生效应的研究

目的通过证实超声介导阳离子微泡能显著提高微泡的携基因量及体内转染后的血管新生效应来探讨阳离子微泡作为基因载体的价值。方法紫外分光光度法检测阳离子微泡与声诺维微泡在体外的基因携带效率。构建兔子急性心肌梗死模型并分组:阳离子微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的阳离子微泡并进行转染)、声诺维微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的声诺维微泡并进行转染)和对照组(不进行转染)。转染后3 d后3组各取3只兔子处死,ELISA检测目的基因蛋白表达情况;转染后4周行超声心动图和心肌超声造影,检测兔子心功能及心肌灌注情况,之后全部处死,免疫组化检测心肌血管新生效应。结果阳离子微泡组基因携带率是声诺维微泡组的11倍。阳离子微泡组SDF-1α蛋白表达是声诺维微泡组的4倍,对照组的9倍。阳离子微泡组在心肌毛细血管新生效应、心肌血流灌注和心功能方面均优于声诺维微泡组和对照组(P<0.05)。结论阳离子微泡能明显提高在体外的基因携带效率,从而使体内转染效率增强,更好地促进心肌血管新生,是一种高效的基因载体。     

超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子促进大鼠心肌血管新生的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)促进大鼠心肌血管新生的有效性.方法 40只健康成年Wistar大鼠随机分为4组.A组在超声微泡治疗前一天行G-CSF皮下注射预处理;B组仅行超声微泡治疗;C组仅行G-CSF皮下注射;D组为对照.于治疗后2周取材,HE染色光镜观察心肌结构变化,免疫组化法检测心肌组织中VEGF及CD34表达,评定心肌血管新生疗效.结果 A组心肌中有大量VEGF和CD34表达,新生血管较多;B组心肌中有部分VEGF和CD34表达,新生血管相对较少;C组及D组仅有极少量VEGF和CD34表达,未见明显新生血管.结论 超声微泡可刺激心肌内源性VEGF分泌,促进心肌血管新生,G-CSF能明显增强其血管新生作用.     

超声微泡介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染鼠缺血心肌的实验研究

目的 探讨超声激活携基因微泡对外源基因在梗死心肌组织中表达的影响及治疗性血管新生在鼠心梗模型中的可行性研究.方法 采用心肌内注射途径,超声激活携基因微泡组注射携碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因微泡后进行超声辐照,单纯基因组和对照组分别注射等量bFGF基因质粒和生理盐水.4周后观察基因表达和促血管新生效应.结果 与单纯基因治疗组相比超声激活携基因微泡组荧光强度和bFGF mRNA表达水平显著提高(P<0.05),且血管新生更明显(P<0.05).结论 超声激活携基因微泡可明显提高bFGF基因在鼠活体心肌的表达,促进血管新生.     

超声介导微泡靶向传输基因促血管新生的实验研究

目的探讨超声介导微泡靶向传输血管内皮生长因子VEGF165促心肌血管新生即心肌“分子搭桥”的新途径。方法利用分子生物学方法构建人血管内皮生长因子真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165;制备载VEGF165基因脂质体微泡,分析其理化性质和功能,在超声场利用超声辐射向大鼠梗死心肌靶向传输VEGF165;2周后取材,逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)评价大鼠心肌中人源VEGF165mRNA表达,蛋白印迹杂交(WesternBlot)观察大鼠心肌VEGF165的蛋白表达,CD34免疫组化微血管密度(MVD)计数半定量法评价超声介导微泡靶向传输VEGF165促梗死心肌血管新生效果。结果①成功构建、克隆血管内皮生长基因VEGF165重组真核表达质粒pcDNA3.1-/VEGF165,测序分析、酶切鉴定准确无误;②研制的脂质体微泡超微结构显示可粘附或包载DNA,粒度分析显示平均粒径<5μm;③在超声介导下该脂质体载基因微泡可靶向传输VEGF165至大鼠梗死心肌,超声介导靶向传输组VEGF165的mRNA、蛋白表达及促血管新生作用(MVD表示)仅次于VEGF165基因心肌注射组。结论超声介导微泡可向大鼠心肌靶向传输VEGF165基因并产生促血管新生效应。     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声波介导微泡破裂促EGFP基因转染大鼠脑组织的实验研究

目的 探讨超声波介导微泡造影剂破裂促外源基因在中枢神经系统转染的可行性.方法 15只大鼠分3组,1组经股静脉输入含绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)的造影剂0.8 ml,立即用超声波照射大鼠颅骨3 min;第2组输入相同的造影剂0.8 ml,不采用超声波照射;第3组输入不含造影剂的pEGFP 0.2 ml,立即超声波照射3 min.48 h后处死大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 只在股静脉输入含pEGFP的造影剂,并经超声波照射的大鼠微血管壁上观察到绿色荧光蛋白表达.结论 以微泡造影剂为基因载体,通过超声波靶向破坏微泡,有可能在脑血管内皮细胞中获得基因转染.     

超声破坏微泡对心肌细胞膜通透性影响的研究

目的探讨超声破坏微泡造影剂对心肌细胞膜通透性的影响。方法将15只昆明小白鼠随机分为3组,一组采用尾静脉输入白蛋白微泡造影剂,胸壁用频率为1MHz,强度为1.5W/cm2的超声进行辐照1min;一组单纯采用同等超声辐照相同时间;一组作为对照。作用后即刻取心肌组织用硝酸镧(La)示踪法做透射电镜观察心肌细胞膜通透性的变化。结果采用超声破坏微泡后可见部分镧颗粒分布于心肌细胞胞浆内,部分分布于线粒体外、细胞核外;单纯超声作用组心肌细胞胞浆中可有少量的镧颗粒分布,而大部分镧颗粒分布于细胞膜外;而对照组镧颗粒分布于心肌细胞膜外。结论超声破坏微泡可提高心肌细胞膜通透性,可能是超声微泡造影剂增强组织中基因转染的机制之一。     

Ultrasound-Mediated Microbubble Destruction Increases Renal Interstitial Capillary Permeability in Early Diabetic Nephropathy Rats

Diabetic nephropathy (DN) is defined as persistent proteinuria corresponding to a urinary albumin excretion rate >300 μg/mg in the absence of other non-diabetic renal diseases. The aim of this study was to determine if ultrasound (US)-mediated microbubble (MB) destruction could increase renal interstitial capillary permeability in early DN rats. Diabetes was induced with streptozotocin. DN rats presented with mild micro-albuminuria 30 d after onset of diabetes. DN rats (N = 120) were divided into four groups that received Evans blue (EB) followed by: (i) no treatment (control group); (ii) continuous ultrasonic irradiation for 5 min (frequency = 7.00 MHz, mechanical index = 0.9, peak rarefactional pressure = 2.38 MPa: US group); (iii) microbubble injection (0.05 mL/kg: MB group); and (iv) both ultrasound and microbubble injection (US + MB group). Another 8 DN rats were subjected to ultrasound and microbubbles and then injected with EB after 24 h (recovery group). EB content, EB extravasation and E-selectin mRNA and protein expression significantly increased, and interstitial capillary walls became discontinuous in the US + MB group. Neither hemorrhage nor necrosis was observed on renal histology. Urine samples were collected 24 h post-treatment. There was no hematuria, and the urinary albumin excretion rate did not increase after ultrasound-microbubble interaction detected by urinalysis. EB content returned to the control group level after 24 h, as assessed for the recovery group. In conclusion, ultrasound-mediated microbubble destruction locally increased renal interstitial capillary permeability in DN rats, and should be considered a therapy for enhancing drug and gene delivery to the kidney in the future.     

超声靶向微泡破坏技术介导自杀基因在恶性肿瘤中的研究进展

恶性肿瘤是全球发病率和死亡率的一个重要原因,严重威胁人类的健康。作为其常规的治疗方法,化疗、放疗和手术仍有局限性。自杀基因疗法为各种形式的恶性肿瘤提供了一种极具前景的治疗手段。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术为自杀基因的传递赋予了新的方式。本文着重就 UTMD 介导的自杀基因转染在恶性肿瘤治疗中的最新进展进行总结并对其未来发展提出展望。     

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠，取3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂，观察对心肌组织显微结构的影响。将另15只急性心肌梗死3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式，将pcDzVEGFm基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影(约6min)；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD。VEGF。基因的造影剂；第三组为对照。2周后，取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色，观察心肌组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况。结果超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血，产生大量空泡，并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应，其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

Spatial Distribution of Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Increases Cardiac Transgene Expression But Not Capillary Permeability

Ultrasound targeted microbubble destruction (UTMD) has evolved as a promising tool for organ specific gene and drug delivery. Using DNA-loaded microbubbles, cardiac transfection has been shown to be feasible. However, two-dimensional properties of the ultrasound beam limit cardiac transgene expression to the focal zone, thus, reducing its potential therapeutic effect. The aim of this study was to test if spatial distribution of ultrasound targeted microbubble destruction in the heart could lead to augmented transgene expression or increased capillary permeability. Lipid microbubbles containing plasmids with a luciferase transgene were used to target rat hearts. The diagnostic ultrasound probe was fixed in a mid-short axis view with a gel stand-off between the chest and probe. Ultrasound (1.3 MHz) with a mechanical index of 1.6 was intermittently applied to rats during microbubble infusion. Rats were randomized to either stay in that position or move horizontally in a cranio-caudal direction (3 mm sweep) relative to the ultrasound probe during UTMD. After 4 days, organs were harvested and analyzed for reporter gene expression. Another group of rats received Evans Blue, followed by UTMD with unloaded microbubbles. Again, rats were randomized into a static or moving group. Hearts were harvested to evaluate extravasation of Evans Blue. Moving rats in a cranio-caudal direction significantly increased transgene expression by 19-fold in the anterior heart, by sixfold in the posterior heart and by 32-fold in the apex. Interestingly, Evans Blue extravasation was not augmented in the moving group. Spatial distribution of UTMD may increase transgene expression due to sonication of larger areas in the heart. In contrast, capillary permeability does not increase, indicating less capillary damage. (E-mail: raffi.bekeredjian@med.uni-heidelberg.de)     

低频超声破坏微泡造影剂开放血脑屏障的实验研究

目的探讨不同强度的低频超声经颅诱导微泡造影剂破坏对大鼠血脑屏障的影响。 方法股静脉注入微泡造影剂后，采用频率43kHz，声强分别为1．2．1．5．1．8．2．3w／cm。的连续超声波经大鼠颅骨照射3min，荧光显微镜观察伊文思兰的渗出。 结果注射微泡造影剂后，声强1．2w／cm^2时超声波即可以开放血脑屏障，随声强的增加脑组织损伤加重。 结论低频超声诱导微泡造影剂破坏可以靶向开放血脑屏障。