番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析

目的：获得取番茄果实特异性E8启动子基因,为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。方法：培养中蔬5号（Zhongshu No.5)番茄幼苗，采集叶片，用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA；设计引物，从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81．1和E82．2启动子基因；克隆进pGEM-T载体，酶切鉴定；送上海基康公司测序；序列分析。结果：从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段；构建重组pGEM-T-E81.1和pGEM-T-E82.2载体，经酶切证实具有与目标片段长度相符的插入片段；测序结果分析显示：番茄果实特异性E8启动子序列高度保守，所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman报道的Cherry种的E82．2启动子同源性为99％，登陆GenBank,ID号为AF515784。结论：成功获得Zhongshu No.5番茄果实特异性E81．1、E82．2启动子基因，为下一步转基因番茄口服疫苗的研制奠定了一定的工作基础。     

果实特异性启动子驱动的含sbr基因植物高效表达载体的构建

目的 构建果实特异性启动子驱动的含编码变形链球菌唾液粘附区(sbr)植物表达载体,进一步提高外源目的基因的表达,为研制有效的转基因植物防龋疫苗打下基础。方法提取番茄基因DNA,利用PCR技术扩增果实特异性启动子E8和2A11基因,双酶切质粒。PROP及PROSC,分别与目的基因连接,构建重组植物表达载体。结果通过双酶切鉴定,目的基因片段已正确整合到植物表达载体中。结论本实验成功构建了果实特异性启动子驱动的含sbr基因的植物表达载体。     

卵巢特异性启动子的研究进展

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率居第三位,病死率居首位,尽管通过手术和化疗后要达到临床和血液生化指标完全缓解,但是多数晚期患者仍会在2~3年内复发,最终结果是化疗耐药死亡。寻找新的卵巢癌治疗方法迫在眉睫。随着分子生物学技术的发展,靶向治疗的研究越来越多,因为肿瘤组织和正常组织之间的差异,通过分子生物技术手段,将药物或者自杀基因靶向导入到肿瘤组织内,而对正常组织无损害。基因的靶向治疗最重要的是将基因转入在体内并在特定的组织内表达,其中最为重要的部分是特异性启动子的作用。文章就启动子的特性,对卵巢特异性启动子的分类及研究进展作综述。更多还原     

HHV-8 ORF50启动子区序列分离、鉴定及在293细胞中启动活性分析

目的：分离和鉴定人类疱疹病毒8型(HHV-8)ORF、50基因上游启动子区序列，评价其在293细胞中启动活性。方法：以佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞总DNA为模板，PCR扩增HHV-8 ORE50启动子区序列，克隆进pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因上游多克隆位点，分别构建含正反双向ORE50启动子重组报告质粒，并分别转染293细胞，作Lu-ciferase活性检测，计算相对Luciferase活性单位(RLU)。结果：①克隆的HHV-8 ORF50启动子区序列长655碱基(bp)，含多个潜在推测AP1、SP1和ERE等转录因子结合序列；②ORF50启动子与正常pGL-3基本载体相比，其RLU增加了26．3倍；③TPA刺激后ORF50启动子与刺激前相比启动活性增加了4．1倍。结论：HHV-8 ORF50启动子区序列在293细胞中具有较强的启动活性；TPA可以作为一有效的阳性对照刺激物用于进一步鉴定ORF50启动子特性。     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

神经特异性启动子PDGF-EGFP载体的构建及组织表达特异性鉴定

目的 构建含有神经特异性启动子PDGF的绿色荧光蛋白真核表达载体,并进行组织特异性鉴定。 方法 提取人外周血基因组DNA,采用PCR技术扩增PDGF-B链上游启动子序列,将其定向克隆至增强型绿色荧光蛋白报告基因表达质粒pEGFP-1中,构建真核表达载体pPDGF-EGFP。将重组载体转染至人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH,以及4种其他组织来源细胞系,观察绿色荧光蛋白表达以鉴定其神经特异性。  结果 成功构建表达载体pPDGF-EGFP,经转染显示pPDGF EGFP在人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH中高表达,而在其它4种非神经组织来源细胞株中极少量表达或未见表达。  结论 重组真核表达载体pPDGF-EGFP有较高的神经组织特异性,为进一步研究神经系统疾病的靶向基因治疗奠定了基础。     

特发性癫痫与载脂蛋白E启动子基因多态性的相关性研究

【摘要】 目的 本研究从载脂蛋白E（APOE）启动子基因多态性的角度探索特发性癫痫可能的发病机制。方法 纳入122例特发性癫痫患者,其中78例为局灶性癫痫患者,44例为全面性癫痫患者,使用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR RFLP）技术检测APOE启动子基因型,运用检验和Logistic回归分析来检测其相关性。结果 发现携带有-427T的癫痫患者中,其局灶性发作的比例显著高于携带-427C的患者,且单因素和多因素回归分析提示-427T是局灶性发作的危险因素。结论 特发性癫痫患者中的局灶性癫痫发作可能与患者携带有APOE启动子-427T相关。     

特异性启动子调控溶瘤腺病毒的研究进展

溶瘤腺病毒是治疗肿瘤的一种有效工具,它能选择性地在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞,而对邻近正常细胞几乎没有影响。利用肿瘤或组织特异性启动子取代控制腺病毒复制必需基因E1A的启动子是构建溶瘤腺病毒的一个策略。现将对这一领域的研究进展进行综述。     

过敏性紫癜儿童血清特异性免疫球蛋白E和免疫球蛋白G检测分析

目的 探讨血清特异性免疫球蛋白E(serological specificity immunoglobulin E,sIgE)及血清特异性免疫球蛋白G(serological specificity immunoglobulin G,sIgG)在儿童过敏性紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP)...     

重组人α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８（ＩＦＮ－α８）高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬｌ－Ｂｌｕｅ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后比活为４．８×１０７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

Cloning and high-level expression of human interferon alpha-8 in E.coli

Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｐｈａ－８ｉｎＥ．ｃｏｌｉＺｈａｎｇＰｉｎｇｗｕ（张平武）；ＷａｎｇＹｉｌｕｎ（王易伦）；ＬｕＤｅｒｕ（陆德如）；ＬｉＹｕｙａｎｇ（李育阳）（Ｉｎｓｔｉ...     

Cloning and sequence analysis of carcinoembryonic antigen promoter from human colorectal carcinoma with relative DNA fragment from normal tissues

Carclnoembryonicantigen(CEA),whichwasoriginallydescribedbyGoldandFreedmanin1965asacolontumor--relatedantigenLI,lsakindoftumor--associatedglucoproteinthatisexpressedinalargepercentageofprimaryandmetastaticcancersincludingcolon,lungandbreastcancers.SomeexperimentsindicatedthatCEAmayfunctionasacelladhesionmolecule,whichcouldplayanimportantroleinembryogenesisandtumordevelopment;'fTheCEAgeneisamemberofalarge,rapidlyevolvingimmunoglubinsupergenefamily,whosegenesrevealahighdegreeofsequencesimila…     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

Cloning of HPV16 E2 Gene from a Biopsied Cervical Cancer Sample

Human papillomaviruses(HPV) infection is recognized as a public health prob-lem for its role as a sexually transmitted disease and also as a critical factor in thepathogenesis of various cancers[1 ] . HPV is a crucial element in the development ofcervical…     

Cloning, sequence analysis and expression in E. coli of the group 3 allergen of Dermatophagoides farinae

Background The dust mites, which are mostly represented by Dermatophagoides spp. （Acari： Pyroglyphidae）, are the major sources of indoor allergens. Identification and characterization of these mite allergen molecules are an important step in the development of new effective diagnostic procedures and possible therapeutic strategies for allergic disorders associated with dust mites. Methods Total RNA was extracted from Dermatophagoides farinae. The gene coding for Der f 3 was amplified by RT-PCR with the primers designed based on previous sequence published in GenBank. The target gene was cloned intermediately into pMD19-T plasmid and finally into plasmid pET28a （＋）, expressed in E. coil BL21 at the aid of the inducer isopropyI-D-thiogalactopyranoside （IPTG）. The physicochemical properties, spatial structure of the allergen were analyzed with bioinformatics software. Results The cDNA coding for group 3 allergen of Dermatophagoides farinae from China was cloned and expressed successfully. Sequencing analysis showed that there were nineteen mismatched nucleotides in five Der f3 cDNA clones in comparison with the reference （GenBank Accession No. AY283291）, which resulted in deduced amino acid sequence incompatibility in eleven residues. Bioinformatics analysis revealed that the Der f 3 pro-protein was an extracellular hydrophobic protein, consisting of 259 amino acids with a 16 amino acid signal peptide. The protein was deduced to have three chymotrypsin active sites （53-68 AA, 108-122 AA and 205-217 AA）, one N-glycosylation site, one cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, four protein kinase C phosphorylation sites, two casein kinase II phosphorylation sites, and five N-myristoylation sites. Conclusions Der f3 is an extracellular hydrophobic protein which possesses multiple activation and phosphorylation sites. Polymorphism may exist in the Der f3 gene but this needs to be further confirmed in the future.