Hath1基因的重组腺病毒转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞的初步研究

目的检测含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况及Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中的表达情况。方法培养新生小鼠耳蜗成纤维细胞,用含有目的基因Hath1的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对其进行转染,转染后24 h通过荧光显微镜观察新生小鼠耳蜗成纤维细胞的转染情况,并通过免疫荧光的方法检测Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中的表达情况。结果含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1能高效转染新生小鼠耳蜗成纤维细胞,Hath1基因在新生小鼠耳蜗成纤维细胞中能有效表达。结论含有人Hath1基因的重组腺病毒Ad-DsRed2-Hath1对新生小鼠耳蜗成纤维细胞的高效转染和有效表达为研究Hath1基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

人成纤维细胞稳定转染的方法比较

目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞,从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法,将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞。24h后,荧光显微镜下观察EGFP表达,流式细胞术测定瞬时转染率;通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56.8%),稳定转染得到的阳性克隆最多,且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d);用阳离子聚合物瞬时转染率低(1.7%),稳定筛选同样可以得到阳性大克隆,但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d);阳离子脂质体转染效果居中,瞬时转染率为39.9%,从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP-N1转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。     

小鼠胚胎成纤维细胞的转染与阳性细胞的初步筛选

目的：建立表达白血病抑制因子（LIF）的胚胎成纤维细胞的方法体系,为建立转基因动物模型提供理论依据。方法：以13.5 d ICR小鼠胚胎为材料,采用胰酶消化方法,培养小鼠原代胚胎成纤维细胞。利用脂质体介导方法,将线性化的pcDNA3.1-LIF真核表达载体转染至小鼠胚胎成纤维细胞中。经G418筛选阳性细胞,提取阳性细胞的基因组DNA并测序。结果：通过对小鼠原代胚胎成纤维细胞的分离、培养,获得原代胚胎成纤维细胞。经过转染,建立了表达LIF的胚胎成纤维细胞,并在倒置显微镜下观察到筛选得到的阳性细胞。对阳性细胞克隆质粒测序表明同源性达99%。结论：pcDNA3.1-LIF真核表达载体成功转染到小鼠胚胎成纤维细胞中。     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法,介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞,探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG,研究不同电压、电容、DNA剂量,孵育温度的条件下,观察细胞存活数,流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml,电压250V、电容700μF,DNA用量30μg时,兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min,电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下,电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性;电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。     

小鼠骨髓基质成纤维细胞与成骨关系的实验研究

目的：研究骨髓基质成纤维细胞与成骨的关系。方法：Luria多器官培养器体外器官培养法，肾被膜下移植技术以及石蜡切片技术，结果：移植物在移植处形成软骨细胞团及骨基质，结论：骨髓基质成纤维细胞集落形成细胞（CFU－F）为基质多能干细胞，能增生分化为成骨所必需的基质细胞。     

一种高效转染西藏小型猪胚胎成纤维细胞的方法

目的应用Nucleofector II核转染仪将外源基因EGFP导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞(PEFs),并与脂质体转染的方法进行比较,寻求一种高效转染猪胚胎成纤维细胞的方法。方法使用Lonza公司的Nucleofector II核转染仪,参考已报道的转染程序与相应的转染试剂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入西藏小型猪PEFs,并与脂质体转染的方法进行对比研究,比较两种方法的转染效率。结果转染5 h后,核转染仪组镜下即可见绿色荧光,转染效率高达80%,远远高于脂质体转染的方法。结论用Nucleofector II核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染,为高效制备转基因克隆西藏小型猪提供了可靠的方法。     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

目的：采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。 方法：分别采用不同剂量（1.25 μl、2.0 μl、2.5 μl）的Lipofec-tamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1 μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。 结果：HilyMax组的转染效率为（86.85%±2.32%）,较Lipofectamin2000组（48.33%±3.24%）、Gbfectene-Elite组（37.35%±5.41%）高（F=18.882,P<0.05）;其中,HilyMax 2.5 μl组的转染效率最高为（90.53%±1.15%）。Lipofectamin2000组的细胞存活率（65.76%±5.78%）明显低于HilyMax组（89.54%±0.86%）、Gbfectene-Elite组（82.45%±3.56%）（F＝90.676,P＜0.05）。 结论：HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5 μl HilyMax：1 μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。     

成纤维细胞生长因子受体2在中毒性耳聋小鼠耳蜗的定位表达研究

目的观察成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）,在中毒性耳聋小鼠（C57）耳蜗中的定位和表达度其FGFR2表达,降低成年小鼠的听功能情况。方法原位杂交检测FGFR2的表达,听性脑干请发电位检测听功能。结果FGFR2在成年小鼠耳蜗的螺旋神经节中表达;无干预措施下,FGFR2功能降低小鼠的听功能度表达与野生型小鼠相比较无明显差异;注射庆大霉素后,两组小鼠中FGFR2的表达增强。结论FGFR2与bFGF共同作用于耳蜗,二者联合对庆大霉素有一定的对抗作用。     

pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒的构建及其在活细胞内的作用

目的:构建pBIFC-VN173-CXCR4和pBIFC-VC155-NT21MP真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察趋化因子受体4(chemokine receptor 4、CXCR4和CD184)与CXCR4抑制性多肽的相互作用。方法:应用化学合成法获得巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(viralmacrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)N端21肽(N-terminal 21-mer peptide,NT21MP)编码的基因序列,克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VC155中,筛选含有目标基因的正确克隆。利用RT-PCR扩增人乳腺癌细胞株SKBR3的CXCR4全长基因后,T-A亚克隆至经Kpn I和EcoRⅠ酶切的pBiFC-VN173载体中。然后,经酶切鉴定及DNA测序分析2个基因是否正确连接至真核表达载体中。应用脂质体转染的方法共转染pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VC155-CXCR4至细胞株COS-7中,在荧光显微镜下观察NT21MP与CXCR4在胞内的相互作用。结果:经DNA测序及同源性对比,证实pBiFC-VC155-NT21MP和pBiFC-VN173-CXCR4重组载体构建成功;基因片段与NCBI基因库vMIP-Ⅱ和CXCR4基因CDS序列同源性达99.9%。BiFC法观察NT21MP与CXCR4在细胞内结合出现的荧光信号,该信号分布细胞内。结论:本实验成功构建了应用BiFC技术的真核表达载体,并且在活细胞内检测到NT21MP与CXCR4的互相结合。     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

抗HIF-1α和survivin基因双靶位miR-RNAi载体的构建及其对胰腺癌细胞的作用

目的:构建抗HIF-1α单靶位(anti-H)、抗Survivin单靶位(anti-S)以及抗HIF-1α和Survivin基因双靶位微小RNA表达载体(anti-H+S),观察和比较这3种载体对胰腺癌Panc-1细胞增殖的影响。方法:设计4组靶向HIF-1α和Survivin基因的寡核苷酸序列,连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒,构建两组共8个载体,依次为anti-H(Ⅰ)、anti-H(Ⅱ)、anti-H(Ⅲ)、anti-H(Ⅳ)和anti-S(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)、anti-S(Ⅲ)、anti-S(Ⅳ)。实时定量RT-PCR检测靶基因mRNA的表达水平,将两组中mRNA下调作用最强的质粒串联,构建anti-H+S。用anti-H+S及mRNA下调作用最强的anti-H和anti-S转染胰腺癌Panc-1细胞,Western blot测定靶蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖活性。结果:经测序鉴定,所有anti-H、anti-S及双靶位质粒anti-H+S装载位点核苷酸序列与设计序列完全相符。anti-H的靶基因mRNA沉默效率依次为48%、2%、44%和30%;anti-S的靶基因mRNA沉默效率依次为72%、75%、58%和59%。由anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)串联得到双靶位质粒anti-H+S。anti-H+S的靶基因mRNA沉默效率为53%(HIF-1α)和42%(survivin)。anti-H(Ⅰ)、anti-S(Ⅱ)及anti-H+S与对照质粒相比均使靶基因蛋白的表达明显下降,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。其中anti-H+S对细胞的增殖抑制作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ),72h后差异有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究成功构建了抗HIF-1α和Survivin的单靶位质粒和双靶位质粒;其中,anti-H+S抑制胰腺癌Panc-1细胞增殖作用强于anti-H(Ⅰ)和anti-S(Ⅱ)。     

脂质体介导SV40LT基因转染构建羊水染色体核型分析质控细胞系研究

目的: 研究羊水染色体核型分析质控细胞系的构建方法。方法: 以T4 DNA连接经BamHⅠ单酶切的SV40LTag-pcDNA和pcDNA3.1（-）DNA,重组SV40LTag-pcDNA3.1（-）克隆,以脂质体介导法将重组克隆转染至染色体结构异常的羊水细胞,以G418筛选阳性克隆,观察细胞系的传代生长特性及其作为染色体核型分析质量评估的可行性。结果: 构建了染色体核型为46,XY,t（8;19）（q24.3;q13.1）的羊水细胞系,传至第15代的细胞系经染色体核型分析,其核型与原代细胞一致。结论: 染色体结构异常的羊水细胞转染SV40LT基因后可转化为无限扩增且染色体核型稳定的细胞系,从而制成羊水细胞染色体核型分析的质控细胞系。     

bcl-2基因转染小鼠造血干细胞重建造血的生物学特性

目的 观察ｂｃｌ－２基因转染小鼠造血干细胞重建造血的小鼠对放化疗的抵抗作用。方法 （１）含ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导转染ＰＡ３１７包装细胞,通过Ｇ４１８筛选和克隆,获得高病毒滴度的细胞株（Ｄ３）;（２）用Ｄ３细胞株的病毒上清转染小鼠胚胎肝造血干细胞;（３）经致死剂量照射小全注ｂｃｌ－２转 造血干细胞重建造血;（５）采用脾集落形成和再增殖能力观察ｂｃｌ－２转因干细胞重建造血     

山仙颗粒对S180肉瘤瘤株转染肠胃功能紊乱小鼠SOD和MDA的影响

目的:探讨山仙颗粒对S180肉瘤瘤株转染的肠胃能紊乱小鼠SOD和MDA的影响,以及抗恶性肿瘤的作用机制。方法:将50只小鼠先造成肠胃能紊乱模型,取其中40只接种瘤细胞悬液,接种瘤细胞悬液24h后开始给药,接种后第10天处死小鼠,采用物理和生物化学的方法计算抑瘤率、胸腺指数及血清中的SOD活性和MDA水平。结果:山仙颗粒、5-FU及联合用药均有明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为29.32%、31.49%和46.27%。5-FU明显降低胸腺指数,山仙颗粒、联合用药对胸腺指数无较大影响,说明5-FU抑制机体免疫功能,山仙颗粒则有提高机体免疫系统功能的作用。山仙颗粒、5-FU对SOD活性和MDA含量的影响均比荷瘤对照组有显著性差异(P<0.05),两药合用效果更明显。结论:山仙颗粒与5-FU均能提高体内SOD活性和降低MDA含量,两药联合应用对小鼠体内SOD水平及MDA含量的影响均优于两种药物的单独使用。     

小RNA干扰对高表达RegIα基因胃癌细胞株增殖的影响

目的:探讨小RNA干扰(small interfering RNA,RNAi)对胃癌细胞株RegIα基因表达的抑制作用及对细胞增殖和凋亡的影响。方法:RT-PCR检测6株胃癌细胞的RegIα基因mRNA表达水平;体外构建RegIα基因小RNA干扰的重组质粒,分别稳定转染RegIα高表达细胞株MKN45和AGS,并设空载体作为对照组;应用RT-PCR和Western blot测定转染后细胞RegIα基因及其蛋白的表达水平;应用MTT法和流式细胞仪检测RegIα小RNA干扰对细胞增殖抑制率和凋亡的影响。结果:RT-PCR显示:与空载体组相比,转染RegIα小RNA干扰质粒后,MKN45和AGS细胞的RegIαmRNA明显被抑制;Western blot结果显示:MKN45和AGS细胞的RegIα蛋白表达水平分别降低至空载体组的(44±4)%和(25±4)%;MTT结果显示:RegIα小RNA干扰后MKN45和AGS细胞增殖均受到抑制,凋亡率分别为(12.96±0.50)%和(11.59±1.10)%,与空载体组比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小RNA干扰可有效抑制胃癌细胞株中RegIα基因的表达,具有抑...     

异丙酚对氯化钾和咖啡因诱发豚鼠耳蜗外毛细胞钙离子移动的影响

目的:评价异丙酚对氯化钾和咖啡因诱发豚鼠耳蜗外毛细胞钙离子移动的影响,探讨其对听觉外周感受器(耳蜗)的作用。方法:急性分离豚鼠耳蜗外毛细胞,选择30个活力较高的外毛细胞,随机分为3组(n=10):对照组(C组)、30μmol/L异丙酚组(P1组)和100μmol/L异丙酚组(P2组)。用Fluo-3AM钙荧光指示剂染色后,P1组和P2组分别给予30、100μmol/L异丙酚或咖啡因处理5min,然后加入氯化钾,采用激光共聚焦显微镜测定细胞内荧光强度的峰值,反映细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。结果:异丙酚可抑制氯化钾诱发的[Ca2+]i增加并与浓度呈正相关,而对咖啡因诱发的[Ca2+]i增加无明显影响。结论:异丙酚可抑制豚鼠耳蜗外毛细胞Ca2+跨膜内流,降低[Ca2+]i,而对内质网功能无明显影响。     

小鼠叉头框C2基因变异致室间隔缺损

目的:探讨叉头框C2基因在心血管发生和发育中的作用。方法：通过敲除小鼠叉头框C2基因,解析敲除叉头框C2基因小鼠的心脏发育情况。结果：在98只新生鼠中仅有15只纯合子型叉头框C2基因突变鼠;这些纯合子型动物心脏的室间隔有细小的缝隙连通左右心室;原位杂交显示在10.5 d的胚胎心室内膜有Fox C2 mRNA的表达。结论：敲除叉头框C2基因可使小鼠室间隔发育缺损。