超声微泡造影剂介导VEGF基因治疗大鼠心肌缺血的实验性研究

目的：探讨超声微泡造影剂介导血管内皮生长因子（VEGF）基因转染大鼠缺血心肌的有效性。方法：将15只急性心肌梗塞3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只，第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式将pcD2VEGF121基因转染大鼠心肌约6分钟；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2VEGF121基因的造影剂；第三组为对照。2周后，分别行免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白及毛细血管内皮细胞，结果：采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强VEGF基因在大鼠心肌组织内的表达，并可促进缺血心肌组织新生血管，结论：超声微泡造影剂介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠，取3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂，观察对心肌组织显微结构的影响。将另15只急性心肌梗死3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式，将pcDzVEGFm基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影(约6min)；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD。VEGF。基因的造影剂；第三组为对照。2周后，取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色，观察心肌组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况。结果超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血，产生大量空泡，并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应，其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性. 方法 18只健康雄性Wistar大鼠,取3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂,观察对心肌组织显微结构的影响.将另15只急性心肌梗死3天后的雄性Wistar大鼠分为3组,每组5只.第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式,将pcD2VEGF121基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影(约6min);第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2VEGF121基因的造影剂;第三组为对照.2周后,取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色,观察心肌组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况.结果超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血,产生大量空泡,并有部分心肌细胞坏死.采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染,能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达.结论超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应,其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法.     

靶向超声介导VEGF_(165)cDNA基因治疗大鼠心肌缺血的实验研究

目的探讨靶向超声介导VEGF165cDNA基因治疗大鼠心肌缺血的可行性。方法将60只心肌缺血的雄性SD大鼠分为3组:超声介导基因组(采用超声破坏微泡造影剂的方法将VEGF165cDNA基因转染大鼠)、单纯基因组(尾静脉输入同等量携带VEGF165cDNA基因的造影剂)、对照组。每组又分为24h后处死组和14d后处死组,每小组为10只。处死后分别行坏死区中性粒细胞记数,梗死区质量比测定,免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白表达,缺血心肌区域毛细血管记数。结果24h处死组:超声介导基因组坏死区中性粒细胞平均为(59.30±7.70)个/高倍视野,单纯基因组为(62.53±7.50)个/高倍视野。14d后处死组:超声介导基因组梗死区质量比明显小于单纯基因组,单纯基因组又明显小于对照组。超声介导基因组有大量VEGF蛋白阳性反应的棕褐色颗粒,而单纯基因组VEGF蛋白阳性反应的棕褐色颗粒少于超声介导基因组。结论超声介导微泡造影剂携带VEGF165cDNA基因能提高基因转染率,促进缺血区毛细血管再生,减少心肌梗死面积,对缺血区炎性细胞的浸润也有一些影响,且基因的转染>24h。     

靶向超声介导VEGF165cDNA基因治疗大鼠心肌缺血的实验研究

目的探讨靶向超声介导VEGF165 cDNA基因治疗大鼠心肌缺血的可行性.方法将60只心肌缺血的雄性SD大鼠分为3组超声介导基因组(采用超声破坏微泡造影剂的方法将VEGF165 cDNA基因转染大鼠)、单纯基因组(尾静脉输入同等量携带VEGF165cDNA基因的造影剂)、对照组.每组又分为24 h后处死组和14d后处死组,每小组为10只.处死后分别行坏死区中性粒细胞记数,梗死区质量比测定,免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白表达,缺血心肌区域毛细血管记数.结果24 h处死组超声介导基因组坏死区中性粒细胞平均为(59.30±7.70)个/高倍视野,单纯基因组为(62.53±7.50)个/高倍视野.14 d后处死组超声介导基因组梗死区质量比明显小于单纯基因组,单纯基因组又明显小于对照组.超声介导基因组有大量VEGF蛋白阳性反应的棕褐色颗粒,而单纯基因组VEGF蛋白阳性反应的棕褐色颗粒少于超声介导基因组.结论超声介导微泡造影剂携带VEGF165cDNA基因能提高基因转染率,促进缺血区毛细血管再生,减少心肌梗死面积,对缺血区炎性细胞的浸润也有一些影响,且基因的转染＞24 h.     

靶向超声介导VEGF_(165) cDNA基因及抗ICAM-1单克隆抗体治疗大鼠心肌缺血的对比性研究

目的 探讨靶向超声介导VEGF_(165) cDNA、抗ICAM-1单克隆抗体及两者协同作用于受损心肌的有效性及可行性.方法 将80只心肌缺血的雄性SD大鼠随机分为四组:第一组采用超声击破微泡造影剂的方法将VEGF_(165) cDNA基因及抗ICAM-1单克隆抗体混合物定向于受损心肌;第二组采用超声击破微泡造影剂的方法将VEGF_(165) cDNA基因定向于受损心肌;第三组采用超声击破微泡造影剂的方法将抗ICAM-1单克隆抗体定向于受损心肌;第四组为对照组只注射生理盐水1 ml,不采用超声波照射.每组分别于24 h和14 d后处死10只.处死后分别行坏死区中性粒细胞记数,梗死区测定,免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白表达,缺血坏死心肌区域毛细血管记数.结果 第一组大鼠心肌缺血治疗效果较第二、第三组效果显著,第一组中性粒细胞浸润以及心肌梗死区域均明显低于其他各组,VEGF蛋白表达以及毛细血管记数明显高于其他三组.结论 采用超声触发破坏含靶基因及抗体的微泡造影剂的方式,可明显对抗心肌再损伤,促进缺血心肌的新生血管再生,改善心肌缺血,且两者协同作用比单独作用效果更佳.     

诊断超声提高脂质体介导血管内皮生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声破坏微泡造影剂的方法提高脂质体介导的血管内皮生长因子(VEGF)基因在内皮细胞中转染率的可行性。方法 脂质体介导VEGF基因转染1h后，将6孔板中的内皮细胞每孔加入造影剂10μl或100μl或500μl，然后置于水槽中，暴露在超声下30s、60s、90s。2d后，用荧光显微镜观察标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。结果 超声照射细胞30s和60s，EGFP基因表达显著提高，照射90s时杀死了大多数细胞。每孔加入微泡造影剂100μl时，其在超声作用下产生的空化作用提高了基因转染效率，造影剂为500μl时，细胞死亡率较高。结论 超声破坏微泡造影剂可以提高脂质体介导的基因细胞转染效率，为今后治疗基因的体内转染提供了经验。     

超声靶向破坏阳离子微泡介导SDF-1α基因转染提高外源性血管新生效应的研究

目的通过证实超声介导阳离子微泡能显著提高微泡的携基因量及体内转染后的血管新生效应来探讨阳离子微泡作为基因载体的价值。方法紫外分光光度法检测阳离子微泡与声诺维微泡在体外的基因携带效率。构建兔子急性心肌梗死模型并分组:阳离子微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的阳离子微泡并进行转染)、声诺维微泡组(超声靶向破坏携SDF-1α基因的声诺维微泡并进行转染)和对照组(不进行转染)。转染后3 d后3组各取3只兔子处死,ELISA检测目的基因蛋白表达情况;转染后4周行超声心动图和心肌超声造影,检测兔子心功能及心肌灌注情况,之后全部处死,免疫组化检测心肌血管新生效应。结果阳离子微泡组基因携带率是声诺维微泡组的11倍。阳离子微泡组SDF-1α蛋白表达是声诺维微泡组的4倍,对照组的9倍。阳离子微泡组在心肌毛细血管新生效应、心肌血流灌注和心功能方面均优于声诺维微泡组和对照组(P<0.05)。结论阳离子微泡能明显提高在体外的基因携带效率,从而使体内转染效率增强,更好地促进心肌血管新生,是一种高效的基因载体。     

超声微泡介导VEGF基因治疗下肢血管闭塞

目的探讨用超声微泡造影剂促进VEGF基因治疗兔下肢缺血的可行性.方法将30只大白兔左股动脉结扎后随机分为3组: A组采用局部注射VEGF质粒DNA; B组采用局部注射VEGF质粒与超声微泡造影剂的混合物;C组作为对照.于治疗后4周进行数字减影血管造影(DSA)和免疫组织化学方法检测侧支循环建立和血管新生.结果 DSA可见用超声破坏微泡后促进侧支循环建立较好,新生血管较多;单纯局部注射质粒可促进部分血管新生,而对照组的侧支循环和新生血管较少.各组免疫组化所测血管计数均有显著性差异.结论用超声微泡介导的VEGF基因转染,可促进缺血骨骼肌的血管新生和侧支循环建立,为下肢缺血性疾病的基因治疗提供了一种新途径.     

超声破坏微泡造影剂促进大鼠心肌血管新生的实验研究

目的探讨超声破坏微泡刺激大鼠心肌内源性VEGF分泌、促进血管生成的新途径。方法正常成年Wistar大鼠30只随机分为3组。第1组超声破坏微泡组，第2组单纯超声辐照组，第3组对照组。每组均进行3次处理。第一次处理3d后每组各取1只大鼠断颈处死后取其心肌，常规HE染色光镜观察心肌结构变化。剩余大鼠于2周后取材，免疫组化检测心肌组织中VEGF表达，CD34免疫组化检测评定超声破坏微泡促进心肌血管新生疗效。结果超声破坏微泡组心肌组织中见大量VEGF和CD34表达，新生血管较多。单纯超声组心肌组织中有较少VEGF和CD34表达，新生血管较少。对照组仅有极少量VEGF和CD34表达，未见明显新生血管。结论超声破坏微泡可刺激心肌内源性VEGF分泌，促进血管新生。     

超声介导微泡破裂法对VEGF体外转染成纤维细胞蛋白表达影响的实验研究

目的利用ELISA检测法观察诊断剂量的超声介导微泡破裂法对VEGF体外转染成纤维细胞蛋白表达的影响并探讨该种转染方法的最佳超声条件。方法实验分组:单纯VEGF质粒转染组;超声 造影剂微泡 VEGF质粒转染组,该组并根据MI(机械指数)分为三组1.2;1.4;1.6。转染后利用ELISA法对各组成纤维细胞的VEGF蛋白表达进行定量检测;利用锥虫蓝染色法比较不同超声强度对细胞活性的影响。结果VEGF质粒转染成纤维细胞后,24h开始即有较高水平的VEGF蛋白表达,表达量于48 h7、2 h呈下降趋势;超声 造影剂微泡 VEGF质粒组(MI1.4、1.6)细胞VEGF蛋白表达量最高,但2组间差异无显著性(P>0.05);以上2组与单纯质粒转染组及MI为1.2组比较有显著性差异(P<0.01);超声 造影剂(MI1.2)组与单纯质粒转染组亦有显著性差异(P<0.05)。锥虫蓝染色法显示:随着超声强度的增加,细胞死亡率呈上升趋势。结论诊断剂量的超声介导微泡破裂转染法能够提高VEGF体外转染成纤维细胞蛋白的表达;使用的超声剂量大,转染率高,但细胞损害大;反之,细胞损伤小,转染率低。     

超声破坏微泡促进骨骼肌血管新生的时间-效应关系研究

目的 探讨超声破坏微泡促进大鼠骨骼肌血管新生的时间-效应关系.方法 将48只SD大鼠随机分为4组(超声破坏微泡组、单纯超声组、单纯微泡组、对照组),超声破坏微泡组经尾静脉输入自制的脂质全氟丙烷微泡造影剂0.5 ml,同时用1.0 MHz、2.0 W/cm2的超声在其大腿骨骼肌局部作用3min;单纯超声组仅在骨骼肌局部用同等的超声能量作用;单纯微泡组仅由尾静脉输入脂质全氟丙烷微泡造影剂0.5 ml;对照组不作任何处理.实验结束后的第3、7、10、14、21、28 d,各组分别取两只大鼠处死,取局部骨骼肌行石蜡切片HE染色观察显微结构的变化,CD34免疫组化计数微血管密度(MVD),酶联免疫吸附试验(ELISA)定量评价血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 超声破微泡组有较多的血管新生;单纯超声组新生血管较少;单纯微泡组和对照组几乎无血管新生.随着时间的变化,超声破坏微泡组的MVD值和VEGF表达在第10 d达到高峰;单纯超声组的高峰出现在第14 d.结论 超声破坏微泡可刺激骨骼肌中内源性VEGF较快、较多地分泌,从而更好地促进新生血管生成.     

超声介导重组腺相关病毒载体心肌靶向转染对大鼠左室心功能的影响

目的 探讨超声造影剂介导下重组腺相关病毒载体(rAAV2-GFP)心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能的变化.方法 健康成年SD大鼠20只,随机分为对照组与实验组:对照组尾静脉注射超声造影剂+超声照射;实验组注射携带rAAV2-GFP造影剂+超声照射.分别于实验前和实验后14 d利用斑点追踪技术测量大鼠周向应变、收缩期应变率,舒张期应变率、扭转角度,并同时测量大鼠射血分数、短轴缩短率、舒张末期容积及收缩末期容积等左心功能指标.行心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况.结果 超声介导重组腺相关病毒心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能指标及相对于心底水平的扭转角度及达峰时间的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 超声及超声造影剂介导重组腺相关病毒载体靶向转染心肌组织对大鼠左室心肌功能无影响.     

超声介导重组腺相关病毒载体心肌靶向转染对大鼠左室心功能的影响

目的 探讨超声造影剂介导下重组腺相关病毒载体(rAAV2-GFP)心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能的变化.方法 健康成年SD大鼠20只,随机分为对照组与实验组:对照组尾静脉注射超声造影剂+超声照射;实验组注射携带rAAV2-GFP造影剂+超声照射.分别于实验前和实验后14 d利用斑点追踪技术测量大鼠周向应变、收缩期应变率,舒张期应变率、扭转角度,并同时测量大鼠射血分数、短轴缩短率、舒张末期容积及收缩末期容积等左心功能指标.行心肌组织冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP的表达情况.结果 超声介导重组腺相关病毒心肌靶向转染前后大鼠左室心肌功能指标及相对于心底水平的扭转角度及达峰时间的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 超声及超声造影剂介导重组腺相关病毒载体靶向转染心肌组织对大鼠左室心肌功能无影响.     

超声微泡造影剂介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的探讨超声破坏微泡介导EGFP质粒转染大鼠视网膜的效率及可行性，为实现外源基因高效、定向的转移目的奠定基础。方法将30只Long-evans大鼠分为6组，第1组仅以0．5w／cm。的超声波辐照大鼠眼球，第2组于尾静脉输入适当剂量的微泡造影剂，并立即以相同能量的超声波辐照大鼠眼球，第3组于尾静脉输入质粒，第4组于尾静脉输入质粒，并以超声辐照大鼠眼球，第5组于尾静脉输入质粒与微泡，第6组尾静脉输入质粒、微泡，并用超声辐照眼球。转染2周后，在激光共聚焦显微镜下观察EGFP表达情况。结果超声微泡介导的EGFP质粒对大鼠视网膜的转染效率，明显高于其他实验组。一定能量和时间的超声波辐照，及适当浓度的微泡，对大鼠视网膜脉络膜无明显损伤。结论利用低频率和一定能量的超声击碎携带EGFP质粒的超声微泡造影剂，能够有效地提高EGFP质粒在大鼠视网膜的转染效率。     

超声破坏微泡对心肌细胞膜通透性影响的研究

目的探讨超声破坏微泡造影剂对心肌细胞膜通透性的影响。方法将15只昆明小白鼠随机分为3组,一组采用尾静脉输入白蛋白微泡造影剂,胸壁用频率为1MHz,强度为1.5W/cm2的超声进行辐照1min;一组单纯采用同等超声辐照相同时间;一组作为对照。作用后即刻取心肌组织用硝酸镧(La)示踪法做透射电镜观察心肌细胞膜通透性的变化。结果采用超声破坏微泡后可见部分镧颗粒分布于心肌细胞胞浆内,部分分布于线粒体外、细胞核外;单纯超声作用组心肌细胞胞浆中可有少量的镧颗粒分布,而大部分镧颗粒分布于细胞膜外;而对照组镧颗粒分布于心肌细胞膜外。结论超声破坏微泡可提高心肌细胞膜通透性,可能是超声微泡造影剂增强组织中基因转染的机制之一。     

经多功能心腔内超声导管超声辐照破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应

目的观察经多功能心腔内超声(ICE)导管超声辐照破坏微泡对动物心肌产生的生物学效应,探索基因治疗缺血性心脏病的新方法。方法 15只犬随机分为US+MB组、US组、对照组3组,每组5只。以介入法将多功能ICE导管送入犬心室。对US+MB在ICE监控下向左心室游离壁注射0.5ml微泡,并以1 W/cm2的声能对注射部位辐照1min;对US组以相同条件行左心室壁辐照,但不注射微泡;对照组在插入导管后不进行任何处理。术后3天处死动物,观察心肌组织大体改变,并行HE染色观察细微结构变化。结果ICE能对注射针的进针深度、微泡注射及辐照过程进行实时监控。观察期内所有动物均正常存活。US+MB组心肌辐照部位出现充血、心肌细胞间隙增宽、少量炎性细胞浸润等改变,US组心肌组织仅出现轻微充血;对照组动物心肌无异常变化。结论经ICE导管超声辐照破坏微泡能在靶区域产生相应生物学效应,内置ICE可对心肌内微泡注射、超声辐照过程进行实时监控。此款新型多功能导管可能为基因治疗缺血性心脏病提供新的、更加安全有效的途径。     

超声破裂载基因微泡增强心肌细胞受磷蛋白反义RNA转染

目的 探讨超声破裂载基因微泡增强心肌细胞反义RNA转染与表达的效应.方法 构建受磷蛋白(phospholamban,PLB)反义RNA真核表达质粒PcDNA 4.1-asPLB,采用磷酸钙共沉淀、超声辐照及超声破裂载基因微泡等方法介导反义RNA转染.采用RT-PCR及Western blot检测心肌细胞PLB、肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic retculum Ca2+ATPase,SERCA2a)mRNA和蛋白表达水平,观察不同方法介导PLB反义RNA转染对心肌细胞PLB及SERCA2a表达的影响.结果 与空载体PcDNA4.1比较,PcDNA4.1-asPLB能特异地抑制心肌细胞PLB表达(P＜0.05).超声破裂载基因微泡明显增强反义RNA转染与表达,与其他转染组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).PcDNA4.1-asPLB对SERCA2a表达无明显影响,但降低PLB/SERCA2a比值.结论 超声破裂载基因微泡是一种高效的反义RNA转染方法,其介导PcDNA4.1-asPLB转染能明显抑制心肌细胞PLB表达.