抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

小鼠IL-33基因cDNA克隆与真核质粒的构建与表达

目的克隆小鼠IL-33基因（mIL-33）cDNA构建其真核表达质粒,并转染EL-4细胞检测其表达。方法提取小鼠脑与肺组织总RNA,经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因cDNA,酶切后插入pcDNA-3.1构建其真核表达载体pcDNA-mIL-33,重组质粒转染EL-4细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。结果 pcDNA-mIL-33中插入的DNA序列测定结果与mIL-33 cDNA序列一致,重组质粒转染EL-4细胞后检测到相应基因表达。结论成功克隆小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

【目的】构建含有人巨细胞病毒（CMV）调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】设计HSV-tkcDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列,将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】酶切见特异酶切图谱,该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因 真核共表达质粒的构建

 【目的】 构建含有人巨细胞病毒(CMV)调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】 设计HSV-tk cDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列, 将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】 酶切见特异酶切图谱, 该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】 含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

 【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

肾癌G250/MN/CAIX抗原基因在酿酒酵母中的诱导表达及意义

【目的】观察G250抗原基因编码区cDNA全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】应用基因重组技术将人G250cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NTC,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NTC-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Westernblot检测。【结果】成功构建pYES2/NTC-G250重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8～12h达高峰。【结论】人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础。     

重组体pcDNA3．1（＋）－tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

【目的】克隆酪氨酸酶基因(tyr)，构建pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并导人NIH3T3细胞表达。【方法】用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3．1( )的T7启动子下游，并用脂质体法导入NIH3T3细胞，RT-PCR，酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。【结果】成功克隆1．74kb的全长tyr cDNA片段，经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致，tyr准确克隆人pcDNA3．1( )的多克隆位点，RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。【结论】本实验成功构建了pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并成功导入NTH3T细胞中表达.     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

肾癌G250/MN/CAIX 抗原基因在酿酒酵母中的 诱导表达及意义

 【目的】 观察G250 抗原基因编码区cDNA 全长基因片段在酿酒酵母中诱导表达情况,并初步探讨其作为肿瘤治疗中的意义。【方法】 应用基因重组技术将人G250 cDNA序列克隆入酿酒酵母穿梭诱导表达载体pYES2/NT C,构建重组酵母真核表达质粒pYES2/NT C-G250并转化酿酒酵母菌株INVSc1,筛选阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的Western blot检测。【结果】 成功构建pYES2/NT C-G250 重组酿酒酵母诱导表达质粒,证实其能够在酿酒酵母中诱导表达,表达量随诱导时间而变化,8 ~ 12 h 达高峰。【结论】 人G250基因片段能够在酿酒酵母中表达,为进一步探讨基因重组酿酒酵母G250 疫苗抗肿瘤效应及其安全性打下基础.     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体。方法以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT。质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体。     

小鼠T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的 构建小鼠T细胞活化衔接因子(LAT)基因的真核表达载体.方法 以小鼠单个核细胞的cDNA为模板,采用PCR扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pCMV-HA中;测序鉴定目的基因并转染哮喘小鼠脾脏淋巴细胞.结果 PCR扩增的特异性片段长度为729 bp,并以此构建重组质粒pCMV-HA-LAT.质粒测序结果与GenBank中的小鼠LAT基因cDNA序列一致;转染哮喘小鼠淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达.结论 成功构建了pCMV-HA-LAT重组真核表达载体.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

鼠白细胞介素-2受体α、β链基因反义RNA真核表达质粒的构建

【目的】构建鼠IL 2Rα与β链基因的反义RNA真核表达质粒 ,为反义RNA基因治疗细胞免疫相关疾病作准备。【方法】用限制性内切酶从克隆载体上切下鼠IL 2Rα与β链cDNA及鼠IL 2启动子 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3的多克隆位点上 ,用酶切或PCR法鉴定正反连接。【结果】得到 4个反向连接的重组质粒 :pcAnti mIL 2Rα ,pcAnti mIL 2Rβ,pcAnti mIL 2Rαβ及pciAnti mIL 2Rαβ。前三者由CMV强启动子指导鼠IL 2R基因反义RNA的表达 ,后者由CMV启动子与鼠IL 2靶向可诱导型启动子组成的融合启动子指导反义RNA的表达。【结论】成功构建了 4个不同类型的鼠IL 2R基因反义RNA真核表达质粒。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoh．DH5（大肠杆菌）,大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine^TM 2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Westernblotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-svnuclein。     

正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆正、反义人PIN1基因（hPIN1）及构建hPIN1基因正、反义真核表达载体.方法 应用RT-PCR技术从人骨肉瘤细胞系MG-63细胞总RNA中成功扩增出990bp包含hPIN1基因编码区的cDNA序列,按正、反方向加上BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点后形成正、反义hPIN1基因,然后连入含BamHⅠ及 HindⅢ双酶切位点的pIRES2-EGFP表达质粒上,构建正、反义hPIN1基因的重组真核表达质粒phPIN1.结果 扩增的cDNA经测秩序与基因文库完全一致;BamHⅠ及HindⅢ双酶切后,正、反义表达质粒形成5.3 ＋0.99kb 两条带,与理论计算值完全一致.结论 成功克隆正、反义人PIN1基因及构建hPIN1基因的正、反义真核表达载体.