梯度密度离心法分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立

 【目的】建立新的肝细胞癌细胞系，为肝癌实验研究提供更多纯化癌细胞。【方法】从肝细胞癌患者原发灶和门脉癌栓中获取癌组织，采用Percoll浓度梯度分离癌细胞进行培养，用微环境消化法获取癌细胞克隆并建立细胞系，对培养成功的细胞系进行生长曲线测定、染色体G带核型分析、对比基因组杂交和裸鼠接种成瘤实验。【结果】对20例肝癌组织进行癌细胞分离培养和克隆，成功建立2例细胞系H2M和H4M，这2株细胞均来自门脉癌栓，它们的染色体数目测定均为超3倍体（71．78条）。CGH检测显示H2M主要的细胞遗传学改变为染色体4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增，其中有一条标记染色体含有1q和6p[t（1；6）染色体]；而H4M染色体8p，9，13q，16q缺失和6p，7p,11p，11q13扩增，其中有一条标记染色体含有一长的均染区（hsr）。H2M细胞接种裸鼠1个月，产生典型的人肝细胞癌，但H4M接种尚未能成瘤。【结论】Percoll浓度梯度分离癌细胞和微环境消化法取得癌细胞克隆是建立原代细胞系的有效方法。2例肝癌细胞系的建立为以后肝癌研究提供了实验材料，所测出的肝癌细胞系的细胞遗传学改变及在裸鼠接种成瘤．为肝癌细胞癌基因和抑癌基因筛选提供了研究线索和实验模型。     

体内连续筛选法建立自发性肺转移人肝癌细胞系

目的　从人肝癌裸鼠肺转移灶中建立人肝癌细胞系 ,为探索肝癌转移的分子机制提供模型。方法　用高转移性人肝癌克隆细胞株MHCC97 H接种裸鼠 ,进行 3次肺转移筛选 ,取肺转移瘤建成皮下接种后自发性肺转移的细胞系。检测下列指标 :形态学、生长曲线、克隆形成率、运动速度、核型分析、流式细胞分析、免疫细胞化学检查、HBVDNA、成瘤性和转移性。结果　从裸鼠肺转移灶中培养出人肝癌细胞系HCCLM3,为多边形上皮性癌细胞 ,亚三倍体核型 ,染色体众数范围 5 5～ 5 8条 ;细胞倍增时间 34 9h ;克隆形成率 32 4 %± 3 2 % ;细胞运动速度 (2 0± 2 ) μm/h ;免疫细胞化学显示甲胎蛋白、白蛋白、细胞角质蛋白 8、P16阳性 ,P5 3、nm2 3、HBsAg阴性 ;细胞基因组中有HBVDNA整合。裸鼠皮下接种成瘤率 10 0 % ,5周后自发性肺转移率为 10 0 % ,肺转移灶中位数 12 1个 /裸鼠。瘤组织原位接种于裸鼠肝脏 ,5周后腹壁转移 10 0 %、腹腔内转移 80 %、肝内转移 10 0 %、膈肌转移 70 %、肺转移10 0 % ,肺转移灶中位数 2 6 8个 /裸鼠。结论　建成一个皮下和原位接种均出现自发性高转移的人肝癌细胞系 ,为研究肝癌转移提供了新的实验模型     

转移力不同的肺癌克隆细胞中nm23-H1基因产物NDPK的表达

【目的】比较转移抑制基因nm2 3 H1表达产物核苷酸二磷酸激酶 (nucleosidediphosphatekinase ,NDPK)在转移力不同的肺癌克隆株中的表达。【方法】通过单细胞克隆技术及裸鼠接种筛选出高转移及低转移的人肺巨细胞癌克隆细胞株及高转移的人肺腺癌克隆细胞株 ,用LSAB免疫组化法检测nm2 3 H1基因产物NDPK的表达。【结果】NDPK在高转移及低转移的人肺巨细胞癌克隆细胞移植瘤及转移瘤中均有表达 ,高转移株的阳性细胞数目及强度均高于低转移株和裸鼠正常肺组织 ;NDPK在高转移的肺腺癌克隆细胞移植瘤中有表达 ,表达强度低于裸鼠正常肺组织。【结论】nm2 3 H1基因对肺巨细胞癌并不具转移抑制基因的功能 ,而可能促进肿瘤的发生、发展和转移。     

裸鼠人肝癌原位移植瘤模型的建立

目的 探讨利用人肝癌细胞系,建立裸鼠人肝癌原位移植瘤模型,在肝细胞癌自杀基因治疗的应用价值.方法 取人肝癌细胞系Be17402和HepG2,制备皮下移植瘤,后将肿瘤组织接种于裸鼠肝内,建立裸鼠肝原位移植瘤模型.HE染色进行病理形态学观察.结果 裸鼠皮下成瘤率为100.0％(4/4).肝内接种肿瘤,裸鼠存活率100.0％(32/32),成瘤率81.3％(26/32);镜下观察肿瘤细胞成浸润性生长;肺、肠系膜淋巴结等组织器官未见肿瘤转移灶.结论 应用人肝癌细胞系建立的裸鼠肝原位移植瘤模型可以很好地模拟人肝癌的解剖学特征,但肝癌转移模型的建立方法尚需探讨.     

人体肝癌细胞系YY-8103若干生物学特征的初步观察

本文报道自肝细胞癌病人的手术切除标本建立的一个人体肝癌细胞系,YY-8103。经形态,超微结构观察,染色体分析,乳酸脱氢酶(LDH)同工酶谱测定,刀豆球蛋白A(Con.A)凝集试验和甲胎蛋白(AFP)检测,确定该细胞系为人体肝癌细胞,至今已传了130多代。该细胞容易接种于裸鼠,而且其瘤结节能在体外再培养。体外培养时该细胞不具有合成乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的功能,但对麻疹病毒及单纯疱疹病毒敏感。因而认为在肝癌基础研究和病毒试验中可得到应用。     

兔肝癌裸鼠移植模型的建立

目的 建立兔肝癌裸鼠模型，为兔肝癌可移植模型的建立奠定基础。方法 利用二乙基亚硝胺诱发日本大耳白兔肝癌，将获得的肝细胞癌接种于裸鼠皮下，并反复传代，将传代瘤块经体外培养后回植于裸鼠皮下，并继续在裸鼠体内传代。结果 肝细胞癌组织前5代对裸鼠致瘤率约40％；经体外传代后移植瘤成活率100％，潜伏期7～10d，无自然消退，无转移。病理检查证实该移植瘤保持着兔肝细胞癌特征，肝细胞抗原阳性，甲胎蛋白阳性。结论兔肝部细胞经传代和体外培养可增加移植成功率，并可缩短时间。     

来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞系CSQT-1的建立及生物学特性分析

目的:从肝癌及门静脉癌栓中分别取材建立人肝癌细胞系,探讨其生物学特性。方法:取人肝癌及门静脉癌栓新鲜手术标本,利用胶原酶消化法进行肿瘤细胞原代培养并扩大克隆培养建系。采用光镜、电镜、染色体核型分析及异种移植瘤实验对新建细胞系生物学特性进行观察。结果:来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞在体外稳定培养已经将近1年,传至100余代,命名为CSQT-1。该细胞系具有典型的恶性上皮细胞特征,其群体倍增时间为48 h;染色体中位数为87~90,为亚四倍体;裸鼠皮下异种移植可形成移植瘤,该细胞系中CD133+表达比较稳定。结论:细胞系特征显示该细胞系是一株新建的来源于门静脉癌栓的人肝癌细胞系。     

分泌乙型肝炎病毒标志物的裸鼠人肝癌移植瘤模型的建立

【目的】建立具有分泌乙型肝炎病毒(HBV)标志物的人肝癌裸鼠移植瘤模型。【方法】采用HBV基因转染的HePG2细胞株(2.2.15细胞)接种于4~6周龄BALB/c-nu裸小鼠项肩部皮下,观察移植瘤出现时间及测量其大小;36 d后处死裸鼠,取血检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和HBV-DNA等HBV标志物及肝癌相关蛋白甲胎球蛋白(AFP),并取瘤组织作病理检查。【结果】出瘤率及肿瘤出现时间与细胞接种量有关;荷瘤鼠血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA检测均为阳性,AFP分泌量达(350±11.5)μg/L;光镜下可见与人肝癌相似的病理改变。该模型一定程度具有类似人HBV复制的原发性肝癌形态学特征。【结论】成功建立了分泌HBV标志物的裸鼠人肝癌移植瘤模型。     

头颈部鳞状细胞癌细胞系染色体核型的检测和分析

[目的] 检测和分析头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)染色体核型,探讨染色体变异与头颈部鳞状细胞癌基因组变异的关系,及其在肿瘤发生、发展过程中的作用.[方法] 18例来源于头颈部不同位置的鳞状细胞癌细胞系进行细胞培养,收集分裂中期细胞,进行染色体"G"带染色,分析核型.并以4例来源于头颈部正常上皮组织细胞作为阴性对照.[结果] 4例对照组上皮细胞均表现为人正常染色体核型.头颈部鳞状细胞癌细胞系核型主要表现为大量复杂的染色体结构重排和数目改变.(1)头颈部鳞状细胞癌染色体核型主要表现为染色体成分/数目的丢失;(2)染色体/臂成分的失衡主要表现为:2q,3p,4,8p,9p,13,14,15,17,18,21,22染色体成分的缺失;及3q,7,8q,11q13,20染色体成分的增加;(3)大部分的染色体断裂点位于着丝粒区域. [结论] 头颈部鳞状细胞癌的染色体畸变是非任意性的,是有规律可循的.染色体数目、结构的不断变异可能造成癌基因活化、扩增,抑癌基因的抑制和缺失;这种多基因改变的不断积累促进了头颈部鳞状细胞癌的发生及发展.     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中PRL-2基因的表达

 【目的】建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肝细胞再生磷酸酯酶2（PRL-2）mRNA表达水平，并应用该法检测原发性肝细胞癌中PRL-2基因的表达。【方法】构建含PRL-2基因开放阅读框架的T载体．制作标准曲线。提取手术切除12例人肝癌、门静脉癌栓（PVTT）和癌旁组织总RNA并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR法观察人肝细胞癌组织和门静脉癌栓及癌旁组织中PRL-2的表达水平。【结果】线性检测范围达5个数量级，最低检测下限为1×10^2拷贝，最高检测上限为1×10^6拷贝。PRL-2在所有的门脉癌栓及10例肝癌组织表达，仅在4例癌旁组织中表达。门脉癌栓PRL-2mRNA表达水平显著高于肝癌及癌旁组织（P〈0．01），肝癌组织表达显著高于癌旁组织（P〈0．01）。【结论】实时荧光定量PCR可以准确定量测定PRL-2基因的表达：PRL-2基因在门脉癌栓的更高表达提示其在肝细胞癌的发生、转移中可能起重要作用。     

原发性肝细胞癌的分离分析

目的　对海门市 10 0个原发性肝细胞癌先证者家系的遗传方式进行研究 ,探讨肝癌可能的遗传模式。方法　应用Li Mantel Gart法和SEGRANB软件进行简单分离分析 ,拟合确认概率π ,分离比 p和散发概率x。用PPAP软件进行综合分离分析 ,估计原发性肝癌可能的遗传模式。结果　Li Mantel Gart法估计的分离比为0 .10 72 46 38,95 %可信限为 0 .0 432 49～ 0 .139898。应用SEGRANB软件 ,以最大似然法拟合的确认概率为0 .2 30 330 3,分离比为 0 .1134 16 1,散发概率为 0 .46 92 795。结果提示肝癌不符合单基因遗传模式。用PPAP综合分离分析结果提示符合多主基因遗传模式 ,估计的基因频率为 3.0 96 75 1× 10 -2 。结论　原发性肝细胞癌不符合单基因遗传模式 ,伴有一定的散发病例 ,是一种多基因遗传病 ,存在多主基因效应     

肝癌基因治疗的研究

肝癌是我国常见肿瘤,基因治疗是正在发展的新疗法。本文对肝癌的基因治疗的基因转移方法、治疗策略、存在问题和发展方向等作一综述,旨在对此有所认识,为今后相关研究打下基础。     

肝癌细胞起源的研究现状

原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。近年研究倾向于认为肿瘤是一种干细胞疾病,而现有的研究认为肝癌组织中也存在少部分肝癌干细胞,是这类细胞的增殖、分化和转移导致了肝癌的生长、转移和复发。但是迄今为止,尚未能成功分离出肝癌干细胞,肝干细胞与肝癌干细胞之间的关系也未得到阐明。因此,寻找特异性更强的肝癌干细胞表面标志物,包括对于功能性筛选方式——SP表型筛选的进一步研究,将是研究肝癌干细胞乃至肝癌起源的关键步骤。     

原发性肝细胞癌组织的肿瘤标记物

应用免疫组化技术（ＰＡＰ法和ＡＢＣ法）以８种肿瘤标记物（ＡＡＴ，ＡＡＣＴ，ＡＦＰ，ＲＣＡ，ＷＧＡ，ＬＣＡ，ＳＢＡ，ＰＮＡ）标记７４例原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）和１０例正常肝组织。结果表明，ＡＡＴ，ＡＡＣＴ，ＡＦＰ，ＲＣＡ阳性率分别为６８．９％，６４．９％，５２．７％，８５．１％，有特异性，是诊断ＨＣＣ有意义的标记物。ＲＣＡ受体出现是ＨＣＣ重要标记，说明癌变后细胞内及细胞表面糖链结构发生变化。ＲＣＡ是否可作为运载生物弹头，作抗癌药物的载体导向治疗ＨＣＣ值得研究。提示多种标记物联合检测可提高阳性率，起到互补作用，大大提高对ＨＣＣ的识别。     

小肝癌临床治疗进展

手术切除是无或轻度肝硬化的小肝癌的最佳治疗方法,而合并严重肝硬化的小肝癌则首选肝移植。近年来,随着微创观念及技术的不断进步,经导管动脉栓塞化疗、经皮无水乙醇瘤内注射、射频消融、微波固化等各种微创治疗方法不断兴起,疗效不断提高。而基于分子生物研究的生物治疗也日趋成熟。     

小肝癌的临床处理体会（附60例报告）

目的总结小肝癌治疗的经验,为肝癌的三早处理提供临床策略。方法回顾性分析20年60例小肝癌患者的临床资料,其中45例合并肝硬化,47例HBsAg阳性;AFP〈20pg／L12例,20～400μg／L31例,〉400μg／L17例;肝功能Child PughA级41例,B级19例。42例予不规则肝切除（7例病人同时行脾切除加贲门周围血管离断术）,3例予不规则肝切除加无水酒精注射,15例予肝左外叶切除。结果术后1,3．5年生存率依次85．1％,67．8％,39．7％。结论早期发现,早期诊断,早期治疗的“三早原则”是提高肝癌生存率的关键;预防小肝癌术后转移复发是提高肝癌疗效的保障。     

肝癌树突状细胞疫苗的研究进展

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,由于起病隐匿,不易早期诊断,手术切除后容易复发转移,且对放化疗均不敏感,总体治疗效果不理想。生物免疫治疗作为继传统肿瘤治疗的第4种模式,联合传统治疗对预防肝癌患者术后肿瘤的复发转移具有重要意义。树突状细胞(DC)是体内功能最强大的抗原呈递细胞,能激活静息期的T细胞,在肿瘤生物免疫中发挥着至关重要的作用,近年来对DC介导的肿瘤生物免疫治疗研究日益增多。     

肝癌高危人群的随访监测及小肝癌的早期筛选

目的为期从肝癌高危人群中筛选出早期肝癌,以提高诊疗效果并收集临床组织标本应用于后续实验研究.方法收集360例患有慢性肝病的中年人群的病例,划定为肝癌高危人群,通过定期的血清学检查及影像学检查对其进行系统的随访监测.结果对照肝癌组和随访肝癌组四项血清学标志物的水平明显高于肝炎后肝硬化组,差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论 AFP,AFU,γ-GT,AFPL3可以作为肝癌高危人群的随访监测及小肝癌的早期筛选.