聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递

 【目的】研究非病毒基因载体聚乙二醇（PEG）-聚乙烯亚胺（PEI）共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物,与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用,测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位,及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力;连接PEG5000能够明显降低复合物的粒径;复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低;细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化,而是取决于PEG的接枝量;共聚物PEG-PEI（2-25-1）被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。     

以聚乙烯亚胺为骨架的转基因载体的研究进展

基因疫苗有三个重要环节,即目的基因、转基因载体和靶细胞,目前基因治疗主要的问题是如何有效地将外源基因释放到靶细胞而又尽可能少的产生不良反应。目前,应用于基因转移的载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类,病毒载体的基因转染效率虽然高,但细胞毒性大,     

基因载体MPEG-PLL共聚物与DNA形成复合物的体外研究

目的 研究非病毒基因载体聚乙二醇单甲醚(MPEG)-聚-L-赖氨酸(PLL)共聚物的组成在体外介导基因传递的影响.方法 将含有不同量MPEG的MPEG-PLL共聚物,与DNA形成复合物.测定MPEG-PLL/DNA复合物的粒径、Zeta电位,并进行凝胶阻滞分析,观察其对Hela细胞的毒性和转染率.结果 MPEG侧链并未...     

聚乙烯亚胺载体介导的基因转移

目的:探讨以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒载体在基因转染中的影响因素.方法:利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的pSVβ表达质粒,含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP质粒转染Cos-7细胞,通过组织化学法测定细胞抽提产物中βgal的表达量和流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例,来测定影响转基因效率的各种参数.结果:在培养液中,6 mg/L聚乙烯亚胺作用NIH 3T3细胞24 h,细胞生存率为64.2%,7 mg/L时细胞生存率为54.4%.聚乙烯亚胺在N/P比3.0以上方可完全结合DNA.溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率;培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率.作为配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒,HEPES缓冲液和生理盐水优于278 mmol/L葡萄糖.在配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒中加入Mg2 可降低转染效率.结论:通过体外细胞试验证明,聚乙烯亚胺是一种有效的真核细胞转染剂和人工合成基因载体的骨架.     

聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究

目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.     

胆固醇-聚乙烯亚胺共聚物的制备及其表征

目的用胆固醇(Chol)对聚乙烯亚胺(PEI)进行改性,制备适用于基因转染的非病毒类载体。方法用胆固醇甲酰氯(Chol-Cl)连接聚乙烯亚胺的氨基形成PEI-Chol脂质共聚物,分别用IR、1H-NMR、凝胶色谱法、DSC对聚合物进行表征。结果在IR图谱上可见1 800 cm-1峰为Chol-Cl的羰基特征峰,形成PEI-Chol后,羰基特征峰迁移至1 700 cm-1,表明聚乙烯亚胺与胆固醇成功连接;根据1H-NMR谱图计算PEI的胺基接枝率、组成及相对分子质量,达到试验预期效果,表明反应可控;凝胶色谱法测定发现聚合物为单峰,表明连接成功,且聚合物相对分子质量的测定值与1H-NMR估算值比较接近;DSC图谱显示PEI连接胆固醇,Chol-Cl的吸收峰消失,熔融峰(Tm)升高变钝,表明PEI-Chol刚性增强。结论成功合成了PEI-Chol脂质共聚物。     

阳离子氧化铁纳米粒作为基因载体的体外实验研究

目的 探讨阳离子氧化铁纳米粒(Cationic IONPs)的制备及其作为体外基因裁体的可行性.方法 改进的共沉淀法制备Fe3O4纳米粒,利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)进行表面修饰.利用原子力显微镜,激光粒度分析仪,琼脂糖凝胶电泳等手段对Cationic IONPs的形貌、粒径、Zeta电位、DNA结合能力等进行表征.以增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)作为靶基因,荧光显微镜和流式细胞仪分别观察和测定Cationic IONPs和脂质体体外转染效率. 结果 Cationic IONPs粒径为(32.1±1.8)nm,在pH=7条件下,Zeta电位为(13.5±1.6)mV,与质粒质量比为1:1时结合效率最高,可以携带pEGFP-C1进入细胞并获得表达,转染效率为(32.8±5.2)%,高于阳性对照组LipofectamineTM 2000转染效率(28.8±5.6)%.结论 氨基硅烷偶联剂修饰的氧化铁纳米粒是一种可用于体外转染的新型非病毒载体.     

聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸-聚乙烯亚胺共聚物作为非病毒载体的研究

目的:选用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸材料作为骨架偶联低分子量聚乙烯亚胺,以构建低毒、高效的新型非病毒性基因载体.方法:用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸(PHPAG)为基本骨架,偶联低分子量的聚乙烯亚胺(PEI 1.8 kDa)形成聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸-聚乙烯亚胺(PHPAG-PEI 1.8 kDa)的载体材料.通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、粒径测定、凝胶体积排除色谱法(GPC)等化学物理方法,凝胶电泳阻滞实验、MTT细胞毒性实验、细胞转染等生物学实验,对聚合物的结构及性能进行研究.结果:成功合成载体材料PHPAG-PEI 1.8 kDa.通过1H-NMR证实材料PHPAG-PEI 1.8 kDa在5或6个氨基酸上能偶合1个PEI 1.8 kDa.GPC结果表明PHPAG、PHPAG-PEI 1.8 kDa 2种材料的分子量约为1.2×104.粒径检测结果显示,PHPAG-PEI/pDNA复合物的平均粒径为200 nm左右.凝胶电泳阻滞实验表明,PHPAG-PEI/pDNA复合物在N/P为3.5∶1时可以完全阻滞DNA.细胞毒性实验表明,在COS-7和A293 2种不同的细胞中,载体材料显示出较低的毒性,与对照组PEI 1.8 kDa相近.在B16细胞、Hela细胞上的转染实验表明,PHPAG-PEI/pCAG-Luc3的复合物在N/P为25∶1时的转染效率最高,高于对照组PEI 25 kDa.结论:PHPAG-PEI聚合物载体材料是一种有潜在用途的非病毒基因药物载体.     

多聚乙烯亚胺介导基因转染的试验研究

目的确定多聚乙烯亚胺最佳的转染条件，评价PEI替代其它转染试剂的可能性。方法以MTT法检测PEI的细胞毒性。以PEI为载体，在不同的N／P比值的条件下，将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞，以荧光显微镜酶检测系统检测其转染效率。结果PEI的细胞毒性较低。当N／P比值为8时，PEI的转染效率最高。结论PEI是一种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体，可以广泛应用于体内外基因治疗。     

一种新型的非病毒基因转运载体--纳米粒基因转运体

基因工程的诞生使人们得以在分子水平上操纵遗传物质 ,基因治疗成为可能。而轰轰烈烈的人类基因组计划的完成和疾病相关基因的克隆 ,为基因治疗的实施奠定了坚实的基础。自 1990年首例基因治疗临床试验获得成功以来 ,多种疾病的基因治疗 ,临床试验不断展开 ,接受治疗的患者人数不断增加 ,获得成功的病例也屡见不鲜。然而 ,就在人们为基因治疗的临床疗效欢欣鼓舞的时候 ,1999年美国宾夕法尼亚大学却发生了因应用重组腺病毒载体不当引发机体致命免疫反应而终死亡[1] 的病例 ,2 0 0 0年法国也发生了用逆转录病毒载体基因治疗一重症联合免疫缺陷…     

纳米基因载体的研究进展

近年来，基因治疗迅速发展。基因治疗的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗成败的关键是基因治疗的载体系统。高效、安全是载体应具备的最基本条件。目前基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占75％，转染效率通常在90％以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的病毒复制、生产成本高、不能反复应用、无靶向性等缺点。特别是在1999年的基因治疗临床试验中出现腺病毒载体致人死亡事件后，人们把注意力与希望逐步转向非病毒载体。非病毒型载体虽然制备简单、无免疫原性和比较安全，但是转染效率低是其致命缺点，尤其是在血清蛋白存在的情况下。所以寻找一种既高效又安全的基因载体是基因治疗领域面临的最紧要课题。     

新型低相对分子质量聚乙烯亚胺耦联载体(PEI-Bu)对大鼠原代骨髓间充质干细胞的基因转染效率及毒性评价

目的 构建新型低相对分子质量聚乙烯亚胺(PEI)耦联载体,评估其对原代大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的细胞毒性及转染效率。方法 利用可降解的氨基甲酸酯化学键耦联相对分子质量为800的PEI 制备低相对分子质量的PEI （PEI 800）衍生物纳米非病毒载体,命名为PEI-Bu;进一步对PEI-Bu压缩DNA的能力、体外降解效率及对原代BMSCs的细胞毒性和基因转染效率进行生物学评价。结果 PEI-Bu能有效压缩质粒DNA并形成稳定的复合物,所形成的复合物粒径约50 nm。与实验室常用的已商品化的相对分子质量为25 000 的PEI （PEI 25 000）相比,PEI-Bu对大鼠原代BMSCs的细胞毒性较小,且基因转染效率更高。结论 作为一种新型的非病毒纳米载体,PEI-Bu能有效转染BMSCs,且安全性较高,具有进一步研发的价值。     

硬脂酸修饰的聚乙烯亚胺作为siRNA载体的体外评价

目的:考察硬脂酸(SA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性及转染siRNA的性能.方法:硬脂酸通过羧基与伯氨基脱水缩合嫁接到PEI分子上;激光粒度仪检测粒径及zeta电位;MTT法评价PEI被修饰后的细胞毒性;流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标仪检测材料转染siRNA的性能.结果:修饰产物PEI-SA结合核酸分子前后粒径分别为(61.2±22.4) nm和(70.9±41.4)nm,zeta电位分别为(25.5±4.5)mV和(18.0±4.5) mV; PEI-SA浓度低于64μg/mL时没有细胞毒性,而修饰前的PEI浓度高于8 μg/mL时就有明显的细胞毒性;PEI-SA对siRNA的转染效率最高可达(94.7±1.3)％,高于修饰前PEI组及脂质体组;转染进入细胞的siRNA量随siRNA的浓度升高及转染时间增长而增多.结论:硬脂酸对PEI的修饰,降低了PEI的细胞毒性,增高了转染效率.PEI-SA可以作为一种有效的非病毒基因载体.     

基于聚赖氨酸和聚乙二醇星形嵌段共聚物的基因载体研究

目的：合成以聚乙烯亚胺（PEI）为内核、聚赖氨酸（PLL）为内层、聚乙二醇（PEG）为外围的系列星形三嵌段共聚物（PEI-g-（PLL-b-PEG））,研究其作为基因载体的性能。方法：用超支化PEI表面氨基引发赖氨酸酸酐的开环聚合,再将活化的PEG以不同接枝率修饰得PEI-g-（PLL-b-PEG）。通过体外细胞实验测定系列共聚物对293T细胞毒性和转染效率。结果：成功合成PEI-g-（PLL-b-PEG）系列共聚物,在共聚物外围接入少量PEG时,不仅可降低细胞毒性,还可有效提高转染效率。结论：PEI-g-（PLL-b-PEG）可用作潜在的非病毒基因载体。     

聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒的制备及其相关特性的研究

目的 制备聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒并研究其理化性质和体外转染活性.方法 通过自由基聚合法制备出聚乙烯亚胺空载纳米粒后,用绿色荧光蛋白(PEGFP-C1)质粒做报告基因,以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA和聚乙烯亚胺结合形成聚乙烯亚胺裁基因纳米粒,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),MTT试验检测聚乙烯亚胺纳米载体HepG2和L-02的细胞毒作用,用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性,用流式细胞仪测定转粢效率.结果 聚乙烯亚胺与聚甲基丙烯酸甲酯形成表面带正电荷的纳米粒,呈单分散球形,平均粒径为102.62 nm,Zeta电位为+46.2 mV.当PEGFP-C1质粒DNA与纳米粒的N/P为3.2:1以上时,两者方可完全结合形成复合物.PEI纳米粒可携带质粒DNA进入COS7细胞,并突破吞噬小泡释放质粒于细胞质,最终质粒聚集于细胞核内进行表达.结论 聚乙烯亚胺纳米粒可以用作基因递送的非病毒栽体系统,值得进一步研究.     

非病毒载体法转染野生型P^53基因对肺癌细胞生长特性的影响

目的：研究非病毒载体法基因转染的最适条件及其潜在价值。方法：利用脂质体介导和配体定向法将带有野生型Ｐ＾５３基因（Ｗｔ－Ｐ＾５３）ｃＤＮＡ的质粒引入细胞,用直接镜检、软琼脂培养、四甲基偶氮唑（ＭＴＴ）法和乳酸脱氢酶法等研究细胞生长特性的改变情结果：绝大多数细胞被转染,肿瘤细胞生长受到明显抑制而发生凋亡。结论：本方法对于基因体外转染是可行的,并且有可能将来用于小细胞肺癌的Ｐ＾５３基因治疗。     

聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物阳离子纳米粒介导宫颈癌细胞基因转染效率的研究

目的 优化聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物(PEI-PLGA)阳离子纳米粒介导的癌细胞基因转染效率.方法 用二步法制备报告基因质粒pCMVβ/PEI-PLA纳米粒复合物,透射电镜观察粒子形态,Zeta粒度仪测定粒径和表面电荷.以pCMVβ基因质粒与纳米粒的比(N/P)、转染时间和基因转染剂量为条件,转染效率为指标,正交设计法优化pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物的转染效率.结果 pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物呈单分散球形,N/P比为10:1,Zeta电位为+16.5 mV,平均粒径为217 nm,基因质粒剂量为每孔3 μg时,纳米粒复合物的转染效率最高为16.35%.结论 PEI-PLGA纳米粒可有效将报告基因质粒转移入宫颈癌细胞,优化实验条件可提高转染效率.     

单端羧基聚乙二醇／鱼精蛋白系统介导HSV-TK基因在官颈癌细胞中的体外研究

目的研究非病毒载体MPEG-C-鱼精蛋白系统的制备方法、其对不同剂量鱼精蛋白与单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV．TK）的结合能力以及对HeLa细胞的影响。方法将一定量的MPEG-C-和不同量的鱼精蛋白混合后与DNA室温孵育,得到MPEG-C-鱼精蛋白／DNA复合物;用琼脂糖电泳实验测定不同N／P比形成复合物时对HSV-TK的阻滞情况;用结合沉淀试验比较不同量鱼精蛋白对包裹HSV-TK的能力的影响;MTF法检测MPEG-C-鱼精蛋白对HeLa宫颈癌细胞的毒性作用及其复合物对HeLa细胞的转染率。结果MPEG-C-鱼精蛋白复合物包裹HSV-TK的能力随N／P比增大而增强：粒径随N／P比增大而减小,可达200nm左右;复合物的Zeta电位随N／P比增大而增强;与单独鱼精蛋白复合物相比．细胞转染率有所降低。结论MPEG-C-鱼精蛋白是一种制备工艺简单、对HSV．TK包裹能力高、细胞毒性小、具有一定价值的非病毒载体。