颅内动脉瘤信号传导相关基因的筛选

 【目的】基因芯片技术建立颅内动脉瘤患者血液单核细胞基因表达谱,筛选与信号传导相关的基因表达情况。【方法】50例颅内动脉瘤患者外周血,10例正常成人作为对照组,分离血液单核细胞,提取总RNA,与含22215个人类基因的Affymetrix寡核苷酸基因芯片杂交、洗脱、染色和扫描,分析检测的数据。荧光定量RT-PCR验证芯片结果。【结果】检测的22215个基因中,颅内动脉瘤共差异表达的基因有325个,差异水平均达2倍以上的基因有35个,生物信息学分析发现信号传导相关基因有7个,其中上调基因5个,下调基因2个。【结论】血液单核细胞基因表达谱是研究颅内动脉瘤发病机制的新策略,多个信号传导相关基因参与颅内动脉瘤的形成和发展。     

应用基因表达谱技术研究人脑动脉瘤细胞信号传导相关基因

应用基因芯片分析人脑动脉瘤基因表达谱 ,分析细胞信号传导相关基因的差异表达。提取 4例人脑动脉瘤标本及作为正常对照的人颅底动脉环标本总RNA、mRNA ,进行线性扩增 ,通过逆转录的方法标记、制成cDNA探针 ,探针与84 6 4点基因表达谱芯片杂交 ,扫描芯片荧光信号图像 ,分析比较差异表达的基因。结果 :在 84 6 4条基因中 ,有 15条细胞信号传导相关基因表达有显著差异 ,其中表达上调 13条 ,表达下调 2条。提示 :差异表达的细胞信号传导相关基因及其参与的病理过程与脑动脉瘤的病理发生有关。     

基于差异基因表达谱的慢性乙型肝炎病证结合研究

【目的】通过检测分析慢性乙型肝炎(简称乙肝)典型证候的差异基因表达谱,探讨乙肝中医证候分型与基因表达之间的关联。【方法】采集乙肝患者和健康者的外周血样本,提取白细胞中的总RNA;运用基因芯片技术检测基因表达,并对其表达谱进行比较分析;使用实时定量RT-PCR验证部分基因表达。【结果】乙肝患者与健康者之间以及乙肝肝郁脾虚证、湿热蕴结证和肝肾阴虚证3个证候的患者之间的基因表达谱均存在明显差异。对3个证候组相对于健康组的差异表达基因进行差异基因、聚类、功能(gene ontology,GO)分析和信号传导通路(Pathway)分析发现,肝郁脾虚证单独调变的基因主要与细胞动力学过程等有关;湿热蕴结证单独调变的基因主要与脂质储存的正向调节等有关;肝肾阴虚证单独调变的基因主要与氮氧化合物合成酶调节物活性等有关。采用实时定量RT-PCR验证部分基因的表达,结果与基因芯片检测结果趋势基本一致。【结论】乙肝肝郁脾虚证、湿热蕴结证和肝肾阴虚证患者白细胞具有特征性的基因表达谱和显著性差异表达基因,提示乙肝中医临床辨证分型具有分子生物学物质基础。     

不同证型系统性红斑狼疮患者外周血基因表达谱差异初探

【目的】比较系统性红斑狼疮(SLE)患者与正常人基因表达谱的改变,寻找SLE中医证候相关基因。【方法】采集静脉血5mL提取总RNA后,反转录合成、标记cDNA探针,与基因芯片杂交后检测。对SLE患者热毒炽盛、阴虚内热型基因表达谱差异进行聚类分析。【结果】发现9例SLE患者与正常人比较均有显著性差异表达的基因89个,涉及细胞因子及受体相关基因、免疫相关基因、细胞信号和传递蛋白、蛋白翻译合成、凋亡相关基因等。两证型大部分基因表达具有一致性,但有明显的表达程度差异。聚类分析结果显示,4例热毒炽盛归为明显一类,5例阴虚内热型患者归为另一类。热毒炽盛型代谢相关基因、急性时相炎症反应相关基因表达水平明显高于阴虚内热型。【结论】SLE的发生是由多基因共同作用的结果,在不同的证候中基因表达水平可能不同;证候微观的生物学基础可能反映为多种非特异性指标的多种组合、变化模式,有待进一步增加样本量继续研究和验证。     

恶性胶质瘤患者外周血淋巴细胞基因表达谱的研究

目的 运用基因芯片技术研究恶性胶质瘤患者和正常人外周血淋巴细胞基因表达差异,以探讨恶性胶质瘤患者免疫细胞的基因表达特点。方法 应用含13824点cDNA的人类基因表达谱芯片分别检测23例恶性胶质瘤患者和40例正常外周血淋巴细胞基因表达差异。提取恶性胶质瘤患者和健康人淋巴细胞的mRNA,反转录制备标有不同荧光素的cDNA探针,将探针与芯片杂交后扫描荧光强度并数字化,用专业软件对检测结果进行分析从而筛选出差异性表达的基因。结果 发现恶性胶质瘤患者淋巴细胞有96个基因呈现差异表达,其中上调表达的基因25个,下调表达的基因71个。结论 恶性胶质瘤患者和正常人的外周血淋巴细胞基因表达存在差异。淋巴细胞DNA结合,转录功能异常和信号传导功能异常可能是恶性胶质瘤患者免疫功能有别于健康人的原因之一。     

本经取穴调控无先兆偏头痛患者基因表达谱的研究

【目的】研究针刺少阳经穴与针刺非经非穴治疗无先兆偏头痛患者前后的基因表达谱。【方法】采用基因芯片技术,分析比较采用经穴（经穴组）和非经非穴（非经非穴组）治疗无先兆偏头痛患者（各10例）后基因表达谱的差异;选取部分基因进行Real-time聚合酶链反应（RT－PCR）,验证基因芯片结果的准确性。【结果】经穴组治疗前后筛选出72个差异基因;非经非穴组治疗前后筛选出110个差异基因。经穴组差异基因涉及的功能包括脑内啡肽酶、 ATP合酶等,与治疗该病的关联性大。但非经非穴组涉及的基因功能广泛且分散,与治疗该病关联性较小,如细胞凋亡、 DNA修复等。 RT－PCR检测了经穴组的ATPAF2、 PTGS2、 TOR3A基因,非经非穴组的ACP2、 AURKA、 ARHGEF11、 CASP8基因,验证了基因芯片数据的可靠性。【结论】本经取穴治疗无先兆偏头痛的经穴效应在分子水平是多基因作用的综合结果,而非经非穴产生的安慰效应并未找到与之对应的与治疗无先兆偏头痛相关的靶基因,进一步证明了经穴效应的存在。     

基因芯片分析Wnt刺激后小鼠多潜能分化干细胞C3H10T1/2的差异基因表达

目的 探讨Wnt信号传导系统对诱导干细胞向神经系统分化的基因表达的影响.方法 采用最新的含有22000多个已知基因及EST克隆的小鼠基因芯片U74Av2,检测了Wnt刺激后的小鼠多潜能分化干细胞C3H10T1/2中目标基因表达的变化,并进行实时定量PCR,验证了基因芯片结果.结果 Wnt刺激后小鼠多潜能分化干细胞C3H10T1/2中Wnt信号传导系统各主要组成基因表达有不同程度增加;对干细胞向神经系统发育有潜在调节作用的基因表达也有增加或减少.结论 表达谱芯片分析成功筛选出wnt刺激引起表达改变且可能与神经发生有关的基因.     

颅内动脉瘤患者血清蛋白组变化的研究

【目的】寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异的蛋白。【方法】采集12例血清蛋白样本（颅内动脉瘤患者4例、脑挫裂伤患者4例及正常成人本4例）用不同的CyDye染料交叉标记后依次进行双向胶内差异凝胶电泳（2-DDIGE）、图像分析及基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）鉴定。【结果】发现胶号为1119的蛋白质点，在颅内动脉瘤患者血清中比正常成人组表达升高1．82倍（P〈0．05），而在脑挫裂伤患者血清中与正常成人的表达差异没有统计学意义（P〉0．05）。该蛋白点经质谱鉴定为结合珠蛋白。【结论】结合珠蛋白在颅内动脉瘤患者血清中表达升高，可能参与了颅内动脉瘤的形成及扩张。     

颅内动脉瘤患者血清蛋白组变化的研究

【目的】寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异的蛋白。【方法】采集12例血清蛋白样本(颅内动脉瘤患者4例、脑挫裂伤患者4例及正常成人本4例)用不同的CyDye染料交叉标记后依次进行双向胶内差异凝胶电泳(2-DDIGE)、图像分析及基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。【结果】发现胶号为1119的蛋白质点,在颅内动脉瘤患者血清中比正常成人组表达升高1.82倍(P<0.05),而在脑挫裂伤患者血清中与正常成人的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。该蛋白点经质谱鉴定为结合珠蛋白。【结论】结合珠蛋白在颅内动脉瘤患者血清中表达升高,可能参与了颅内动脉瘤的形成及扩张。     

缺氧/复氧后鼠脑星形胶质细胞基因表达谱的初步分析

目的　该实验利用基因芯片技术研究缺氧 /复氧处理后鼠脑星形胶质细胞基因表达谱的变化 ,以深入认识星形胶质细胞在缺氧 /复氧处理后基因表达变化规律 ,为进一步全面认识神经胶质细胞在缺氧和缺血再灌注等情况下基因变化规律以及神经胶质细胞与神经元在损伤条件下相互依存关系提供实验依据和理论基础。方法　取人鼠脑星形胶质细胞作传代培养 ,传至第四代分组作缺氧 /复氧处理 ;用TRIzol试剂经过多个步骤提取制备好的星形胶质细胞样本总RNA ;利用基因芯片技术获取缺氧 /复氧处理后鼠脑星形胶质细胞的基因表达谱 ;利用GeneOntologyConsortium分析系统、OeneCards数据库和Pubmed检索系统对基因表达谱进行初步分析。结果　①基因表达谱 :在基因芯片测定了 4 0 96个点 ,共有差异表达基因 187个 ,其中 ,差异表达基因 187个 ,己知差异表达基因 4 6个 ,未知差异表达基因 14 1个 (EST片段 )。②已知差异表达基因 :在 4 6个已知差异表达基因中 ,表达下调的基因有 4 1个 ,表达上调的基因有 5个 ,未见报道的与缺氧 /复氧处理相关基因 2 3个 ,己报道的有 18个。③已知差异表达基因功能聚类 :共 10类 ,其中代谢 2 3个、信号传导 9个、细胞生长 3个、结构蛋白 2个、免疫应答 4个、运输 1个、细胞周期 1个、细胞增殖 1个     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

肿瘤特异性报告基因载体的构建

目的：将构建一种能在肿瘤组织中进行肿瘤行异性表达的逆转录病毒载体，增强肿瘤基因治疗的靶向性。方法：PCR法获得HER2基因的启动子片段并将其克隆至逆转录病毒载体P^LXSN中，再将突变型绿色荧光蛋白（mtGFP)基因克隆至该启动子下游。结果：质粒P^LHSN经EcoR I和BamH I酶切后可切出510bp和5.8kb两条片段；质粒P^LHGSN经BamH I酶切可切出520bp和6.7kb两条片段。结论：成功构建了携带HER2基因启动子和mtGFP报告基因的逆转录病毒载体。     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。