胸腺肽类药物对体外诱导ES细胞分化为T细胞的作用

 【目的】研究目前临床常用的增强细胞免疫功能的胸腺肽，胸腺5肽和胸腺素α-1在小鼠胚胎干细胞向T淋巴细胞分化过程中的作用。【方法】借助小鼠胚胎干细胞（ESC）体外自然分化形成的类胚体（EB）中含有三胚层细胞的独特细胞环境，加入多种细胞因子和胸腺多肽，体外诱导小鼠ESC向T淋巴细胞分化。利用流式细胞仪检测在三种不同胸腺多肽的诱导下．不同时间点的小鼠ESC来源的细胞表面CD3分子的表达水平。并在相应时间点通过RT—PCR检测与T淋巴细胞发育密切相关的Notch信号分子的转录水平。【结果】在加入胸腺肽和胸腺素α1诱导的实验组，均有细胞表达CD3分子，CD3^＋细胞的百分比随诱导时间的增加而增多；而加入胸腺五肽的实验组无CD3^＋细胞出现。加入胸腺素α1和胸腺肽的实验组．有Notchl及其配体delta-like-1和delta—like-4的转录；而加入胸腺五肽的实验组的细胞无Notch1及其配体转录。【结论】胸腺素α1或胸腺肽可能通过影响Notchl信号途径支持ES细胞向T细胞分化，而胸腺五肽无此作用。     

胸腺肽α1对恶性肿瘤化疗患者T细胞亚群的影响

目的：观察胸腺肽α1对恶性肿瘤化疗患者免疫功能的影响。方法：联合组32例恶性肿瘤患者化疗期间同时给予胸腺肽α1皮下注射。单化组30例恶性肿瘤患者采用单纯化疗未接受胸腺肽α1治疗。正常组为30例正常人。对其3组例外周血T细胞亚群进行检测,并观察联合组及单化组治疗前后T细胞亚群的变化。结果：对照组外周血T细胞亚群各项指标显著高于联合组及单化组肿瘤患者（P〈0.05）。联合组患者加用胸腺肽α1后T细胞亚群各项指标较用药前明显提高（P〈0.05）,单化组治疗前后各项免疫指标差异无统计学意义（P〉0.05）。治疗后联合组T细胞亚群各项指标较单化组明显提高（P〈0.05）。结论：恶性肿瘤患者存在明显的免疫功能下降,胸腺肽α1可提高恶性肿瘤化疗患者细胞免疫功能。     

胸腺肽α1对老年晚期恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响

目的 :观察胸腺肽α1对老年恶性肿瘤患者细胞免疫功能的影响。方法 :30例老年恶性肿瘤患者 ,用胸腺肽α1治疗 2个月 ,第 1个月每日 1.6 mg,第 2个月隔日 1.6 mg,均为皮下注射 ,观察治疗前后 T细胞亚群及 NK细胞、患者生活质量、血常规及肝肾功能变化。结果 :30例患者用胸腺肽α1前 ,CD4、CD4 /CD8、NK细胞分别为 (32 .33± 6 .2 5 ) %、(0 .77± 0 .2 3) %、(16 .0 5± 6 .79) % ,治疗后为 (39.4 2± 9.2 6 ) %、(1.19± 0 .5 3) %、(2 4 .37± 8.2 3) %。治疗前后比较均有显著意义 (P<0 .0 5 ) ,患者生活质量分值治疗后比治疗前显著提高 (P<0 .0 5 )。结论 :胸腺肽α1能提高老年晚期恶性肿瘤患者的细胞免疫功能 ,是较理想的免疫增强剂。     

ES细胞体外定向分化为睾丸间质样细胞模型的建立

目的:建立小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞体外分化为睾丸间质样细胞(leydig-like cells)的模型。方法:采用脂质体转染方法将含类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF-1)基因片断的质粒转入小鼠ES-D3细胞,并在RA和8Br-cAMP作用下,体外诱导ES-D3细胞分化为睾丸间质样细胞,以空质粒转染组做阴性对照;通过光镜观察转染SF-1的ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞过程中的形态变化;用RT-PCR及Western Blot法检测分化过程中类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR),胆固醇侧链裂解酶P450scc(CYP11A1)和3β-羟甾脱氢酶1(3β-HSD1)表达情况;免疫荧光法检测睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc及3β-HSD1表达。结果:ES-D3细胞转染SF-1质粒24 h,即检测到SF-1基因表达。转染成功的ES-D3细胞在RA和8Br-cAMP诱导分化48 h后出现睾丸间质样细胞。分化而来的睾丸间质样细胞胞体大而圆润,长有触角,呈纺锤形;且表达睾丸间质样细胞特异性蛋白P450scc和3β-HSD1,同时StAR表达显著增加,而对照组细胞未表达睾丸间质样细胞特异性标志物StAR、P450scc和3β-HSD1。结论:通过对ES-D3细胞转染SF-1质粒并予以RA和8Br-cAMP诱导,成功建立ES-D3细胞定向分化为睾丸间质样细胞模型。     

T细胞体外培养体系的研究进展

T细胞在许多涉及免疫功能紊乱的皮肤病，如银屑病等发病过程中的作用已得到肯定，鉴于骨髓是众多免疫细胞的来源，结合近年来国内外研究成果推测，骨髓在这些疾病的发病过程中可能发挥着极为重要的作用。利用造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有多向分化的能力，在体外适宜的微环境下可以使其定向分化为成熟的T淋巴细胞。     

体外诱导Balb／C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察

目的 体外诱导Balb／C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团，观察细胞表面形态学的变化。方法 选用Balb／C小鼠ES细胞．经过拟胚体(EB)发育分化4d后开始定向诱导培养，不同时问段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子，使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团。免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞。原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团。结果EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团，细胞团内细胞排列紧密。胰岛B细胞数量多，主要分布在细胞团的中央，边缘少，染色较淡。而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘，数量相对较少。AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团，其表面有很多类似神经纤维的纤维束，连接成网络状。在细胞质中，还有很多类圆形的颗粒物质，其大小几乎一致．粒径都处于0．5～1．0μm间。结论 诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟，而且还具备良好的组织结构，为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。     

原发性肝癌TACE及胸腺肽α1治疗对T淋巴细胞亚群的影响

目的：探讨TACE术后应用免疫调节剂胸腺肽α1对患者T淋巴细胞亚群的影响。方法：收集2005年3月至2009年1月收治的36例HCC患者作为研究对象,根据治疗方法不同将研究对象随机分为胸腺肽α1治疗组（17例）和肝癌对照组（19例）,另选择同期12例门诊健康体检者作为正常对照组。比较T细胞亚群变化及AFP、ALT、总胆红素、淋巴细胞总数等指标。结果：行TACE治疗后l、7d,肝癌对照组患者体内CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T、CD4＋／CD8＋比值与TACE治疗前比较,差异有统计学意义（P〈0．05）：胸腺肽α1治疗组在TACE术后应用胸腺肽α1治疗7d后,CD4＋T、CD4＋／CD8＋、淋巴细胞的比值明显增加,与治疗前及肝癌对照组术后7d比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：TACE术后应用胸腺肽α1可明显提高患者的细胞免疫水平,改善肝功能。     

胸腺肽α1对肝癌动脉插管化疗栓塞患者T细胞亚群影响

目的：研究胸腺肽α1(日达仙，Tα1)对肝癌动脉插管化疗栓塞(TACE)患者T细胞亚群的影响。方法：把20例接受TACE治疗的肝癌患者随机分为不用Tα1组(对照组)和用Tα1组(观察组)，分别用流式细胞仪计数患者CD3^ 、CD4^ 、CD4^ ／CD8^ 、NK细胞阳性百分率化疗前后的变化。结果：用Tα1组的CD3^ 、CD4^ 、CD4^ ／CD8^ 、NK细胞的阳性百分率于化疗后明显高于对照组。结论：Tα1可以提高肝癌TACE患者的免疫功能。     

胸腺肽α1对慢性阻塞性肺疾病急性加重的预防作用

目的探讨胸腺肽α1对慢性阻塞性肺疾病患者急性加重的预防作用及其机制。方法将80例稳定期慢性阻塞性肺疾病患者随机分为治疗组和对照组,对照组给予必要的解痉和祛痰等基础治疗,治疗组在此基础上接受胸腺肽α11.6mg皮下注射,隔日1次,共注射10次;二组患者均观察6个月,每2周经门诊随访1次,进行临床情况评价,并于治疗前、治疗后3个月及6个月检查患者肺功能、血清IgA、IgG、IgM、CD3、CD4和CD8水平。结果在治疗3个月和6个月后,治疗组患者发生急性加重人数和急性加重天数均明显低于对照组(P<0.05),而治疗组患者在治疗后血CD4及CD4/CD8比值明显升高(P<0.05)。结论胸腺肽α1通过增强患者细胞免疫功能,可有效地预防慢性阻塞性肺疾病的急性加重。     

胸腺肽辅助治疗银屑病对T淋巴细胞亚群的影响

目的　观察胸腺肽辅助治疗银屑病时T淋巴细胞亚群的变化 ,以期了解胸腺肽对于银屑病患者免疫功能的影响。方法　将 15 4例银屑病患者在正规抗银屑病治疗的基础上随机分为治疗组 (加用胸腺肽组 )、对照组 ,对两组患者的T淋巴细胞亚群进行检测。结果　两组患者治疗前CD+ 3 、CD+ 4 、CD+ 8、CD+ 4 CD+ 8均值间差别均无显著性意义(P >0 0 1) ,而治疗后差别均有显著性意义 (P <0 0 1)。结论　胸腺肽对于银屑病患者的免疫功能有一定的调节作用。     

无血清无饲养层条件下培养小鼠胚胎干细胞

目的 研究在无血清无饲养层条件下小鼠胚胎干细胞的培养方法,为最终建立无血清无饲养层培养系统打下基础.方法 比较小鼠胚胎于细胞ES-S8株在无血清培养体系和有血清培养体系中的生长情况,分析ES-S8细胞克隆形成效率,测定其生长速度;然后在撤去血清和饲养层的条件下培养ES-S8细胞,进行AKP染色和表面标记物SSEA-1免疫荧光检测.结果 ES-S8细胞在无血清培养条件下细胞生长速度减缓,克隆形成率降低,但AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性;在无血清无饲养层条件下ES-S8细胞培养仍能形成克隆,且AKP染色、SSEA-1免疫荧光均显阳性.结论 研究表明ES-S8细胞能够在无血清无饲养层的培养条件下生长,保持其良好的未分化特性.     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力.方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞.采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定.采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性.结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上.生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力.结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究.     

胚胎干细胞来源的饲养细胞支持自体胚胎干细胞生长

目的探讨小鼠胚胎干细胞(mESCs)来源的饲养细胞是否具备支持自体mESCs未分化生长的能力。方法先诱导mESCs形成类胚体(EB),进一步诱导其分化为成纤维细胞(mEB-dFE),以用作饲养细胞。采用形态学、集落形成率、细胞分化率、免疫细胞化学、碱性磷酸酶染色和RT-PCR对生长在mEB-dF上的mESCs的未分化特性进行鉴定。采用RT-PCR和诱导mESCs体内外分化方法鉴定mESCs多分化潜能特性。结果从EB三个发育阶段(EB贴壁10、15、20 d)分离出48个mEB-dF系,其中5个(来自15 d的EB)能维持mESCs未分化生长和多潜能性达10代以上。生长在这种饲养层上的mESCs与生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上一样,其特性无明显差异,均表达碱性磷酸酶和特殊的mESCs标记,包括SSEA-1、OCT-4、NANOG,在体外形成EB和体内形成畸胎瘤;其他43个mEB-dF系则不具有这种能力。结论研究不仅为mESCs体外培养提供了一种新的饲养细胞,避免了MEF作饲养细胞的许多不足;而且还提示mESCs可诱导出不同功能的成纤维样细胞,其差异的分子机制值得进一步研究。     

胚胎干细胞定向分化为脊髓运动神经元

目的 探讨胚胎干细胞(ESC)分化为运动神经元的方法.方法 用含重组人白血病抑制因子(LIF, 1 000 U/μl)的培养液培养胚胎干细胞,第3天,悬滴法培养拟胚体(embryoid body, EB),第5天添加音猬酸(sonic hedgehog,Shh,5 nmol/L)和维甲酸(RA,1 μmol/L),再培养5 d;然后将EB贴于铺有基质胶(matrigel)的培养皿上.采用免疫细胞荧光及流式细胞术检测运动神经元的分化.结果 胚胎干细胞可以在LIF存在条件下撤去饲养层细胞,并保持未分化状态,碱性磷酸酶和OCT-4检测阳性.Shh和RA处理后5 d,胚胎干细胞可以分化为运动神经元,运动神经元核转录因子HB-9阳性:未经Shh和RA处理的胚胎干细胞几乎没有HB-9阳性细胞.流式细胞检测(36.09±8.68)%EB细胞HB-9阳性表达.结论 胚胎干细胞在特殊的细胞因子作用下可以定向分化为特定的神经元;该培养方案可以定向分化胚胎干细胞为运动神经元.     

Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞的建系及体外神经分化

【目的】 建立Nestin-GFP转基因小鼠的胚胎干细胞(mESC)系,并观察其示踪ES细胞系的神经分化过程。【方法】将E3.5的Nestin-GFP小鼠囊胚接种于小鼠胚胎成纤维细胞上(MEF经γ射线照射失去增殖活性)。4 ~ 6 d后将自囊胚长出的内细胞团(ICM)继续培养并传代扩增 ,检测所得细胞Oct-4、SSEA-1和AKP等胚胎干细胞特异性标志物的表达及在体内外向三胚层分化的能力;之后,诱导细胞向神经元样细胞及神经胶质样细胞分化,利用免疫荧光检测其标志性抗原。【结果】 免疫组化可见Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct-4、SSEA-1、AKP染色呈强阳性,并具有向体内外三胚层分化潜能;在体外诱导其向神经分化,第6 d可见到明显的绿色荧光,并与免疫组化Nestin表达部位基本吻合。第12 d及第16 d分别可见神经元及神经胶质细胞特异性标志物表达,而此时Nestin的表达较前明显下降。【结论】 成功建立了Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞系,该细胞具有自我更新的特性及多向分化潜能,并可用于在体外更直观的监测神经分化的阶段性变化并由此进行调控。     

含不同启动子的GFP载体在不同种属的胚胎干细胞系中的表达效率

目的:对比含不同启动子的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体在hESC及小鼠胚胎干细胞(mESC)的表达效率,为探索ESC及其衍生细胞移植在体内的存活、迁移、分化及整合提供有力的细胞模型。方法:阳离子脂质体转染hESC及mESC ES-D3,荧光显微镜下观察阳性克隆,流式细胞术(FCM)计算不同载体pCX-hrGFP、pIRES-hrG-FP在不同种属细胞中的表达效率。结果:两种载体在mESC的表达效率分别为pCX-hrGFP(90±2.5)%,pIRES-hrGFP(0.67±0.02)%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。在hESC的表达效率分别为pCX-hrGFP(0.8±0.1)%,pIRES-hrGFP(0.62±0.08)%,两组间比较有统计学差异(P<0.05)。pCX-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率差异有统计学意义(P<0.01),pIRES-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:①CBA启动子引导的GFP表达效率高于CMV启动子。②同一载体在不同种属细胞内表达效率不同。     

EGF对原始生殖细胞来源小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响

目的观察表皮生长因子对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响。方法以小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层,从原始生殖细胞中分离克隆小鼠胚胎干细胞的过程中,在基础细胞培养液中加入不同浓度的表皮生长因子,观察小鼠胚胎干细胞集落形成数和各组的最高传代数。结果表皮生长因子添加与否对原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞原代培养无显著的影响,而对后继培养有显著影响。结论在原始生殖细胞来源的小鼠胚胎干细胞分离的过程中,可以不添加表皮生长因子,而在胚胎干细胞的后续传代中,尤其对于较高代细胞的克隆过程中添加表皮生长因子有利于细胞的生长。