深低温反复冻融杀伤人眼脉络膜黑色素瘤OCM-1细胞的机制

 【目的】研究-70℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制。【方法】OCM-1细胞反复冻融后，用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力，免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化，电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变，并测定细胞的凋亡比率，流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化。【结果】噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示，冻融可以直接杀伤OCM-1细胞，且残存的细胞生长能力也明显受抑制。免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性，而冻融后的细胞均呈阴性，冻融后培养的细胞部分呈阳性。电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化。激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多。流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降，冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显，且呈一定的量效关系。【结论】冻融不仅可以明显杀伤OCM—1瘤细胞，还能抑制残存瘤细胞生长。反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡，此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因，其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关。冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。     

抗原负载的DC和CIK共培养后对MGC-803的杀伤活性

【目的】研究负载抗原后的树突状细胞（DC）对细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）增殖活性、表型和功能的影响。【方法】分离外周血单个核细胞（PBMC），经不同细胞因子作用后定向分化成DC和CIK细胞，以胃癌细胞株MGC-803冻融物作为肿瘤抗原刺激DC后与CIK共培养，以流式细胞仪检测CIK细胞膜表面分子表达，MTT法检测共培养后CIK细胞对MGC-803杀伤活性的变化。【结果】CIK与负载MGC-803抗原的DC共培养后3d增殖活性开始显著提高，最高增殖倍数可达1179．5±1．29；CD3^＋CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞较共培养前增多，且与负载抗原的DC共培养的CIK具有比单独培养的CIK更强的杀瘤活性。【结论】以肿瘤细胞冻融物诱导成熟的DC能进一步促进CIK增殖，提高其对胃癌细胞的杀伤活性，为指导临床应用DC和CIK联合治疗消化道肿瘤提供了实验依据。     

大蒜素诱导人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的研究

【目的】探讨大蒜素对人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的影响。【方法】MTT法检测大蒜素对BIU87细胞生长的影响：倒置显微镜、TUNEL法观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期的变化；半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-2，bax，caspase-3 mRNA表达的变化，比色法测定caspase-3活性变化。【结果】大蒜素能明显抑制BIU87细胞的生长，与大蒜素的浓度和作用时间有关，5mg／L大蒜素作用5d可以杀死50％以上的细胞；可诱导BIU87细胞凋亡，细胞周期阻滞在S-和G2期；凋亡相关基因bcl-2表达减少，bax无明显变化，caspase-3表达及活性增高。【结论】诱导细胞凋亡是大蒜素发挥抗瘤效果的一种重要机制；凋亡发生可能与细胞周期阻滞、bcl-2和caspase-3基因表达及活性变化有关。     

主动免疫治疗对不明原因反复自然流产患者NK细胞的影响

【目的】探讨主动免疫治疗对不明原因反复自然流产（URSA）患者外周血自然杀伤（NK）细胞的影响。【方法】选取确定的URSA患者34例，通过流式细胞仪测定其在主动免疫治疗前、后外周血中NK细胞亚群百分比。【结果】主动免疫治疗能显著降低URSA患者外周血中CD56^＋CD16-NK细胞亚群水平（P〈0．05）、CD56^＋CD16^＋NK细胞亚群水平（P〈．05）、CD56＋NK细胞水平（P〈0．05）。【结论】主动免疫治疗可以调节URSA患者外周血NK细胞的水平，改善URSA患者NK细胞的免疫状态，因而NK细胞的检测可用于指导主动免疫治疗的临床应用。     

二烯丙三硫抑制人前列腺癌细胞生长

【目的】 研究二烯丙三硫(DATS)对人前列腺癌PC-3细胞的生长抑制作用及相关机制｡ 【方法】 MTT法测定DATS对PC-3细胞生长的影响;细胞形态学,流式细胞仪(FCM)等检测细胞凋亡;western blot､比色法分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和Bcl-xL/Bcl-xS的表达以及Caspase-3活性变化｡ 【结果】 DATS明显抑制PC-3细胞的生长,呈浓度和时间依赖性;DATS作用72 h的IC50为14 μmol/L;14 μmol/L DATS作用PC-3细胞不同时间后,细胞凋亡率增高;western blot显示凋亡抑制蛋白Bc1-2､Bcl-xL表达减少,比色法表明Caspase-3活性增高｡【结论】 DATS诱导细胞凋亡是其抑制前列腺癌PC-3细胞生长的重要机制,该机制可能与Bc1-2､Bcl-xL和Caspase-3表达及活性变化有关｡     

清热解毒和补益中药对小鼠腹水肝癌H22细胞的作用及免疫学机制比较

【目的】比较清热解毒中药和补益类中药对小鼠腹水肝癌H22细胞的作用及免疫学机制。【方法】选择冬凌草、半枝莲为清热解毒中药代表药,并与补益代表药黄芪进行比较;将50只KM小鼠随机分为模型组、冬凌草组、半枝莲组、黄芪组和热休克处理对照组(热休克组)。在活体肝癌H22腹水细胞腹腔接种后当天,冬凌草组、半枝莲组和黄芪组分别以30、 15、15 g·kg-1·d-1的剂量灌胃给药,连续12 d;热休克组小鼠以43℃热处理20 min,每4天1次,共3次;模型组不予任何处理。12 d后处死小鼠,分别抽取腹水制片,光镜下观察细胞形态,并采用免疫组化法检测腹水CD4 、CD8 T细胞表达。【结果】冬凌草组、半枝莲组和热休克组见腹水肝癌H22细胞大量坏死和凋亡,黄芪组对肿瘤细胞形态无明显影响;冬凌草组和半枝莲组腹水中CD4 、CD8 表达均升高,而热休克组则主要是CD8 表达升高,黄芪组以CD4 表达升高为主。【结论】清热解毒中药可致小鼠腹水肝癌H22细胞坏死和凋亡,机制可能与其提高细胞免疫功能,从而增强机体对肿瘤细胞的免疫杀伤能力有关。黄芪未见有直接杀伤肿瘤细胞的作用,其抗肿瘤作用可能主要是通过提高CD4 的表达而实现的。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA疫苗 在小鼠体内的免疫反应

:【目的】探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应。【方法】将恶性疟原虫FCC 1/HN株重组质粒pcDNA3 Pfs2 5及 pcDNA3 EBA175 /HRPⅡ经骨骼肌途径分别单独注射或两者混合注射免疫BALB/c小鼠 ,观察免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4 /CD8 T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化。【结果】pcD NA3 EBA175 /HRPⅡ与 pcDNA3 Pfs2 5分别单独肌肉注射或两者混合肌肉注射免疫小鼠后 ,均可见血清IgG抗体滴度增高 ;针对恶性疟原虫抗原的特异性T淋巴细胞增殖反应增强 ;CD4 /CD8 T细胞比率下降以及NK细胞杀伤活性增强。【结论】提示肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫有性期阶段或无性红细胞阶段的重组质粒单独或两者混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫反应和NK细胞杀伤活性。     

C-Myc／Fas基因转染对人颊癌细胞移植瘤的影响

 【目的】探讨C-Myc／Fas基因BcaCD885细胞裸鼠移植瘤内转染的抑瘤效果，了解分子机制。【方法】构建人颊癌BcaCD885细胞裸鼠移植瘤模型，实验动物分3组，每组16只。分别瘤内注射脂质体、脂质体，pBK-fas、以及脂质体／pBK-Fas／pcDNA3-C-Myc共聚物，观测移植瘤增殖，绘制生长曲线。转染72h后每组处死6只动物，RT-PCR检测移植瘤细胞FasmRNA表达。流式细胞术（Flowcytometry，FCM）检测Fas蛋白表达和移植瘤细胞凋亡、增殖水平。【结果】Fas转染、C-Myc／Fas共转染抑制肿瘤增殖，生长抑制率分别为47．33％±2．29％和49．93％±5．15％，差异无显著性（P〉0．05）。Fas转染、C-Myc／Fas共转染增强移植瘤细胞FasmRNA表达，提高Fas蛋白阳性表达率、阳性表达强度和凋亡指数。共转染组增殖指数为65．45％±7．11％。高于对照组和Fas组（53．26％±6，37％和51．93％±7．51％），差异有显著性（P〈0．01）。对照组和Fas组差异无显著性（P〉0．05）。【结论】Fas、C-Myc／Fas转染抑制人颊癌细胞裸鼠移植瘤增殖与增强Fas表达、促进细胞凋亡有关。     

CD44v6和survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

【目的】探讨细胞黏附分子CD44v6和凋亡抑制蛋白survivin的表达与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期及预后的关系。【方法】应用免疫组织化学方法检测56例膀胱移行细胞癌及5名正常人膀胱黏膜标本中CD44v6和survivin的表达。【结果】56例膀胱癌的CD44v6和survivin的表达总阳性率为57．1％和85．7％，且随着癌细胞分化程度降低、癌组织浸润深度增加CD44v6的表达减弱，而survivin在分级和分期的表达无统计学差异。CD44v6和survivin的表达与肿瘤复发无明显相关。【结论】CD44v6的表达与膀胱移行细胞癌的分级、分期有关，有助于膀胱癌早期诊断；survivin的高表达率可能成为膀胱移行细胞癌辅助诊断指标之一。     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01／04增殖抑制的作用机制

 【目的】研究thapsigargin（TG）对体外培养的人品状体上皮细胞系SRA01／04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】不同浓度TG处理SRA01／04细胞72h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17／19ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】MTT法测得TG为0．325～5μmol／L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0．8μmol／L；透射电镜显示TG处理SRA01／04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成；流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0．1，0．5，1，10μmol／L分别处理SRA01／04细胞72h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性；TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加，TG为10μmol／L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01／04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。     

人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性

【目的】建立人主动脉．性腺-中肾(AGM)区基质细胞系，研究其生长特性及表面标志的表达。【方法】取孕30～35d的人胚胎分离培养AGM区基质细胞，传代培养成系并检测其增殖能力，应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标志和细胞外基质蛋白成分。【结果】人AGM区基质细胞呈成纤维样形态，指数生长期倍增时间约为16h。流式细胞仪检测结果显示CD31、CD34、CD45在人AGM区基质细胞表面为阴性表达，而CD29、CD44、CD105、CD166均为阳性表达。免疫荧光检测结果显示AGM区基质细胞表达细胞外基质蛋白Tenascin、Fibronectin、Laminin及α-SMA。【结论】人AGM区基质细胞系呈现造血组织特异的相关分子表达特征，可以作为研究造血发生机理的模式细胞。     

恶性实体瘤患者外周血细胞因子诱导的杀伤细胞增殖与杀瘤活性

 【目的】探讨恶性实体瘤患者外周血来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖能力、免疫表型及杀瘤活性。【方法】用rhlFN-1，rhlL-2，Anti-CD3mAb与恶性实体瘤患者外周血单个核细胞共孵育。分别在培养第4、7、10、13天进行细胞计数，通过流式细胞术检测细胞免疫表型及MTT法检测对K562细胞的杀伤活性。【结果】恶性实体瘤患者外周血单个核细胞与rhIFN-γ，rhIL-2，Anti-CD3mAb孵育4、7、10、13d，细胞数分别增加（2．5±1．6）、（11．9±3．5）、（22．3±7．8）和（29．5±6．1）倍。CD3^＋、CD4^＋,CD8^＋和CD3^＋CD16^＋CD56^＋细胞在培养第13天分别从（62．8±7．6）％、（31．5±5．8）％、（44．9±8．2）％和（1．3±1．1）％增加到（89．3±9．5）％、（50．1±7．2）％、（57±9．0）％和（37．0±12．7）％。对K562细胞的杀伤效应在第4、7、13天分别为（23．6~8．5）％、（56．4±7．2）％和（80．1±4．5）％。【结论】rhIFN-γ,rhIL-2和Anti-CD3mAb诱导恶性实体瘤患者外周血单个核细胞活化为以CD34^＋CD16^＋CD56^＋为主的细胞因子诱导的杀伤细胞，细胞增殖力强，并对K562细胞有强大的杀伤活性。     

土槿皮乙酸作用PI3K/Akt通路诱导HeLa细胞凋亡

 【目的】探讨土槿皮乙酸对宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的作用。【方法】通过Hoechst 33342荧光染色等观察细胞核固缩和染色体碎片等形态学变化，MTT法测定土槿皮乙酸对HeLa细胞的生长抑制作用，采用流式细胞仪和免疫印迹实验检测MTT法测定HeLa细胞的生长凋亡情况及其相关蛋白的表达变化。【结果】 土槿皮乙酸对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用，并能诱导细胞发生凋亡，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高。土槿皮乙酸抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中，细胞磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B (Akt)、糖原合酶激酶3（GSK3）、FKHRL (Forkhea like family)表达水平及活性显著降低，导致抑制凋亡抑制因子bcl-2受到表达抑制，同时Bax表达增加。【结论】土槿皮乙酸能够通过多条信号途径促进人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡，通过抑制PI3K/Akt的活性是其体外诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡和抑制增值的重要作用机制。     

冬凌草甲素作用PI3K/AKT通路诱导HeLa细胞凋亡

 【目的】研究冬凌草甲素诱导HeLa细胞凋亡的作用及其机制。【方法】MTT法测定冬凌草甲素对HeLa细胞的生长抑制实验,Hoechst 33342荧光染色等观察细胞核形态学变化;LDH法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡,免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。【结果】25μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高,冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低。【结论】冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa细胞生长作用,抑制Akt和GSK3的活性是冬凌草甲素体外诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡的重要作用机制之一。     

冬凌草甲素作用PI3K/AKT通路诱导HeLa细胞凋亡

【目的】研究冬凌草甲素诱导HeLa细胞凋亡的作用及其机制。【方法】MTT法测定冬凌草甲素对HeLa细胞的生长抑制实验,Hoechst 33342荧光染色等观察细胞核形态学变化;LDH法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡,免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。【结果】25μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高,冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低。【结论】冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa细胞生长作用,抑制Akt和GSK3的活性是冬凌草甲素体外诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡的重要作用机制之一。     

胎肝造血期胎肝间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

【目的】分离、培养人胎肝造血期胎肝间充质干细胞（MSC），研究其生长特性及表面标记的表达。【方法】取孕16～20周人胚胎肝脏，分离培养胎肝MSC，传代培养成系并检测其增殖能力，应用流式细胞术、免疫荧光方法检测其造血相关表面标记和细胞蛋白表达。【结果】人胎肝MSC呈成纤维样形态，指数生长期倍增时间约为16h，细胞增殖26．5倍。传代15次仍有94．18％的细胞处于GO／G1期。流式细胞仪检测结果显示人胎肝MSC表达CD29、CD44、CD105、CD106和CD166，不表达CD31、CD34、CD45，不表达与GVHD相关的HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L。免疫荧光检测结果显示胎肝MSC表达造血微环境细胞外基质蛋白Fibronectin、α-SMA及上皮细胞标记蛋白AFP和E-cadherin。【结论】人胎肝MSC具有胚胎造血组织和发育中的肝脏特异的相关分子表达，免疫原性弱，可以作为研究造血、胎肝发育机制的模式细胞。     

塞来昔布对人恶性淋巴瘤Raji细胞株增殖、凋亡及Survivin表达的影响

【目的】探讨塞来昔布对人恶性淋巴瘤Raji细胞的作用及其可能机制。【方法】体外培养人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞，用不同浓度塞来昔布进行干预。采用MTT比色法检测Raji细胞生长情况；流式细胞术分析塞来昔布对Raji细胞周期分布的影响并检测细胞凋亡及Survivin蛋白在细胞中的表达情况；应用RT-PCR法检测Raji细胞中Survivin mRNA的表达水平。【结果】塞来昔布对Raji细胞生长具有抑制作用，且在12．5～150μmol／L范围内呈时间、剂量依赖性；流式细胞术检测出典型的“凋亡峰”，凋亡率（9．20±0．19）％～（44．63±1．34）％；塞来昔布使Raji细胞G0／G1期细胞数增多，S和G2／M期细胞数减少，凋亡率和细胞周期分布呈量效依赖关系；塞来昔布下调Raji细胞中Survivin蛋白和Survivin mRNA的表达。【结论】塞来昔布抑制Raji细胞增殖、诱导其凋亡可能与阻滞细胞周期和下调Survivin表达有关。     

CD158a表达调节胃癌患者CTL细胞功能的体外研究

目的 研究CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响.方法 利用免疫磁珠法分选培养表达与不表达CD158a的两型细胞,MTT法测定其体外杀伤胃癌MNK45细胞的活性,Elispot试验检测其分泌细胞因子的变化,RT-PCR方法 检测其mRNA的表达差异及CD158a受体激发后(Trigerring)的细胞毒T细胞凋亡情况.结果 CD158a+ CTL几乎不杀伤人胃癌MNK45细胞,但阻断相应CD158a分子或靶细胞MHC-1分子后,杀伤活性得到一定程度恢复.CD158a- CTL以分泌γ-IFN为主,参与Th1反应,而CD158a+ CTL主要分泌IL-4,可能介导Th2反应.3例胃癌患者的CD158a+ CTL细胞均可扩增出300 bp的P58.2 cDNA特征性条带.CD158a分子激发后,CD158a+ CTL凋亡细胞具有显著的形态学特征,DNA电泳有典型的"ladder"梯型条带.结论 CD158a表达抑制胃癌CTL体外杀瘤活性,影响其细胞因子的分泌,并在激发后诱导CTL细胞凋亡.     

人参皂甙肠道代谢物CompoundK对人胃癌细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响

目的观察人参皂甙肠道代谢物CompoundK（CK）对人胃癌细胞BGC823细胞增殖、凋亡的影响。方法实验分组：对照组（PBS溶液）,实验组（浓度分别为2．5、5、7．5、10μmol／L）。噻唑蓝（MTT）比色法分别检测CK作用于细胞后其活力及生长抑制率;流式细胞术检测CK作用后细胞周期时相、凋亡率;免疫印迹法（Westernblot）检测凋亡相关蛋白的表达。结果5μmol／LCK作用细胞48h时,细胞生长周期阻滞于G2／M期,细胞凋亡率为（21．17±3．16）％;Westernblot检测显示Bcl-2,Bid蛋白表达随着药物浓度的增加而减少,Fas和Fas—L蛋白表达量却没有明显变化。结论CK是通过线粒体介导的凋亡通路途径来诱导人胃癌细胞发生凋亡的。