体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性,研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSC,进行培养扩增,观察其生物学特性;用5-杂氮胞苷(5-AZA)诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增;流式细胞仪分析所培养的P3代细胞为纯度超过95%的MSC;P3代MSC经5-AZA诱导后1周,相差鼹微镜下见细胞呈长梭形、多核;2周可见肌管样结构;细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

骨髓间充质干细胞的克隆培养及其向心肌细胞的诱导分化

目的 建立骨髓间充质干细胞(MMSC)的单细胞克隆，筛选具有心肌特异性分化潜能的c-kit^ MMSC克隆，进行体外心肌诱导分化研究。方法 取成年雄性SD大鼠骨髓细胞，进行原代培养和单克隆培养。通过c-kit免疫细胞化学标记和RT—PCR检测，筛选出向心肌特异性分化的MMSC克隆。然后用5-氮杂胞苷诱导分化，RT-PCR检测诱导前后心肌特异性基因表达的变化。结果 骨髓中含有多种MMSC克隆，以不同形态和大小的成纤维细胞样克隆数目最多。较大的成纤维细胞样克隆和扁平多角形细胞克隆均表达c-kit。用5-氮杂胞苷诱导后，表达Nkx2．5的c-kit^ MMSC克隆的细胞形态和排列方式发生变化。诱导后2周，细胞变为短柱状，且平行排列；第3周，相邻细胞间形成明显的细胞连接；第4周，由多个细胞相互连接形成肌管样结构，并可观察到肌管的自发性搏动。心室肌特异性肌球蛋白轻链(MLC-2v)mRNA从第3周开始明显表达。结论 骨髓中含有多种干细胞克隆。筛选具有心肌特异性分化潜能的MMSC克隆并构建心肌干细胞库，将为临床干细胞移植治疗心肌梗死提供理想的干细胞来源。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新、分化、增殖的和多向分化的潜能。在体内、体外通过各种物理、化学因素可将其诱导分化为心肌细胞。以此来替代坏死的心肌细胞,改善心脏功能,防治各种缺血性心脏病,减少心肌重构等,具有广阔的临床应用前景。     

骨髓间充质干细胞的诱导分化研究

随着组织工程学的不断发展，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSCs）被研究证明可以诱导分化为多种组织细胞．尤其是在骨组织工程中得到了很好的应用．有望成为骨组织工程重要种子细胞来源。     

电磁场干预大鼠骨髓间充质干细胞向心肌方向诱导分化的研究

【目的】观察脉冲电磁场（PEMFs）对5-氮胞苷（5-aza）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响。【方法】50Hz脉冲低频电磁场刺激5-aza诱导7d后的MSCs,根据不同的感应强度和作用的时间分为A、B、C组和1、2、3、4亚组,设未暴露PEMFs的为对照组。通过Western印迹法检测不同条件下心肌肌钙蛋白T的变化。【结果】0．5、1和5mT组中20min、30min各亚组cTnT的表达量较对照组,5mT组在10min的表达量减少。【结论】50Hz的0．5～5mT感应强度的PEMFs作用20～30min为促进体外5-aza诱导MSCs向心肌方向的分化的有效窗口。     

骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化的影响因素

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有干细胞的一般特性,主要存在于骨髓基质中,具有横向分化潜能,可以向3个胚层细胞进行分化。近年来,许多学者通过实验研究BMSCs在体外诱导分化为神经样细胞的机制。体外培养、扩增BMSCs分别采用化学诱导剂或生物诱导剂可诱导BMSCs分化神经样细胞,并表达神经元标志物。本文就对BMSCs向神经样细胞诱导分化的影响因素予以综述。     

脉冲微交流电刺激促进体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌分化

目的 探讨脉冲微交流电刺激对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用.方法 常规方法 分离培养鼠骨髓间充质干细胞,取P3细胞进行5-氮胞苷诱导,诱导后以是否给予脉冲微交流电刺激分为两组,观察各组细胞生长情况、细胞形态学及超微结构改变,免疫细胞化学方法 检测、cTnT、Cx43的表达.结果 脉冲微交流电刺激组细胞较非刺激组生长良好,更早出现心肌样细胞改变,诱导后1周可观察到胞内肌丝形成及、cTnT、Cx43的表达,且在随后的相同时相点(诱导后2、3、4周),、cTnT、Cx43表达水平明显高于非刺激组,胞内肌丝也由杂乱分布逐渐成束,部分细胞可观察到肌节.结论 模拟心脏跳动的脉冲微交流电刺激有助于经5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞在体外分化为功能完备的心肌样细胞.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外向肝样细胞的诱导分化

目的：研究人骨髓来源的间充质干细胞（human bone marrow derived mesenchymal stemcells,hBM-MSCs）在肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）、抑瘤素M（OSM）诱导下,体外向肝样细胞的诱导分化。方法：通过密度梯度离心和贴壁培养法获得hBM-MSCs,分离的hBM-MSCs扩增传至第6代,流式细胞仪检测hBM-MSCs表面CD34、CD45、CD105、CD166表达。第6代hBM-MSCs生长达100%融合时采用两步法对hBM-MSCs进行诱导分化。第1～第14天采用IMDM诱导培养基（含2%FCS、20ng/mL HGF、20ng/mL FGF-4）,第15～第21天在上述培养基中加OSM（10ng/mL）,促进诱导细胞的成熟,同时收集第0、第7、第14、第21天培养上清液标本,ELISA法测ALB浓度。诱导培养21d后采用RT-PCR、免疫荧光技术检测诱导后肝细胞特异标志CK18、ALB的表达,PAS染色检测诱导MSCs糖原储存。结果：传至第6代的hBM-MSCsCD34、CD45表达阴性,CD105、CD166表达阳性。在细胞因子...     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化

目的:探讨成人骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件. 方法:从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用2-巯基乙醇(BME)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定. 结果:诱导1 h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,4 h后大部分细胞具有典型神经元形态,表达晚期神经元标志物-中间神经丝蛋白(NF-M),部分具有神经元形态的细胞表达微管相关蛋白-2 (MAP-2). 结论:成人骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

诱导人骨髓间充质干细胞向运动神经元分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stemcells,hMSCs）在体外诱导向运动神经元分化的潜能。方法用密度梯度离心法分离hMSCs,在含有10%FBS的DMEM/F12培养基中的培养扩增。将传代后的第1代hMSCs分为诱导组和对照组,诱导组的细胞在完全培养基中加入终浓度为10μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预处理24h后,用0.5μg/mL维甲酸（RA）和200ng/mL音速波状蛋白（shh）联合诱导10d。对照组不加上述诱导剂。光镜下观察其分化过程中hMSCs的形态变化,免疫组化检测诱导前后细胞是否表达神经干细胞特异性标志蛋白,用流式细胞仪检测是否产生运动神经元及在总的细胞数种所占比率,并用流式软件分析结果。结果诱导组hMSCs经诱导后能分化为具有典型神经元形态的细胞,部分细胞表达抗人神经巢蛋白（Nestin）,表达率达到（25.0±4.8）%;流式检测诱导后运动神经元特异性标志蛋白HB9表达,表达率达到（50.0±5.3）%。对照组细胞形态无改变,无Nestin表达,HB9表达小于5%。结论hMSCs在体外条件下能诱导分化为运动神经元样细胞。     

心肌细胞介导骨髓间充质干细胞的心肌样分化

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在不同培养条件下定向分化过程中的生物学特性变化及其机制.方法贴壁法分离大鼠MSCs,培养至第6代.实验分3组:条件培养基组,用新生鼠心肌细胞培养上清液制成的条件培养基处理MSCs48 h 2次,其间间隔48 h;混合培养组,新生鼠心肌细胞和MSCs按1:1的比例混合培养1周;对照组,MSCs常规培养.检测各组MSCs中心肌细胞结构功能蛋白:心肌肌联蛋白(titin)、肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、心肌组织缝隙连接的特异性组成蛋白质Connexin43(Cx43)的表达情况.结果①条件培养基可诱导MSCs心肌样分化,表达心肌细胞骨架蛋白titin的Z带及A带部分,Cx43大量表达,但在检测期内未观察到MHC的表达;②MSCs在混合培养中与心肌细胞形成连接,表达titin,部分细胞内可检测到类似肌小节的结构,Cx43集中分布于细胞相邻的界面;③对照组中的部分MSCs可少量表达Cx43及titin.结论源于心肌细胞的各种因素可促使MSCs心肌样分化,分化的程度取决于作用信号的性质.     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的：初步观察MSCs墨体内诱导分化为心肌细胞的能力。方法：从大鼠双侧股骨骨髓获得MSCs，在体外纯化、扩增后，DAPI进行细胞标记，然后注射到急性心肌梗塞模型鼠和正常大鼠的心肌组织内，饲养2～4周后，处死动物在注射点获取心肌标本，初步采用肛染色和电镜观察形态学的方法对分化的心肌细胞进行鉴定，并用免疫组化法从组织学上对转化心肌细胞进行心肌特异性抗原的检测。结果：MSC进行DAPI的标记效率高，电镜观察与宿主心肌细胞问形成了闰盘，组化检测有心肌特异性抗原的出现。结论：在宿主心肌组织内，MSCs具有分化为心肌细胞的能力。