造血干/祖细胞移行能力及影响因素的实验研究

目的：研究纯化脐血CD34^ 细胞移行穿越血管内皮细胞能力及影响因素。方法：免疫微磁珠阳性选择法（MACs)纯化脐血CD34^ 细胞，流式细胞仪测定基质细胞衍生因子（SDF－1α）受体（CXCR4）表达率；与干细胞因子（SCF）、白介素（IL）－6，IL－3及flt3配体（FL）共同孵育12小时，静脉内皮细胞株（ECV）接种于transwell滤膜上层，研究CD34^ 细胞在SDF－1α作用下移行穿越ECV的能力，transwell滤膜孔径为8μm，并观察阻断其表面粘附分子（CD62L、CD62E和VLA－4）后对迁移的影响。结果：CD34^ 细胞在自然状态下也能少量通过ECV细胞层，SDF－1α可显提高CD34^ 细胞移行能力，通过率与CD34^ 细胞表面CXCR4表达相关；CD34^ 细胞与SCF与IL－6共同孵育后，可明显提高其穿越ECV细胞的能力（P＜0．01）；单独或联合应用抗粘附分子抗体显减少CD34^ 细胞的穿内皮细胞移行（P＜0．01）。结论：CD34^ 细胞可穿过ECV内皮细胞层向SDF－1α浓度高的一侧移行，与IL－6和SCF共同培养后可增强CD34^ 细胞的移行能力，抗粘附分子单抗显减少CD34^ 细胞的移行。     

黄芪多糖对脐血造血细胞凋亡的影响

目的探讨黄芪多糖对脐血造血细胞凋亡作用的影响。方法采用淋巴细胞分离液分离出脐血中的单个核细胞（MNC）,IMDM培养基加入不同浓度的黄芪多糖进行无血清体外培养48h和72h。收获培养后的细胞用AnnexinV-FITC和半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）荧光分别标记,流式细胞技术分析测定细胞的凋亡表达情况。结果在无血清IMDM培养液中培养后,AnnexinV及Caspase-3在脐血造血细胞表面均有表达。培养48h后在黄芪多糖40μg／ml组,细胞表面Annexin V及Caspase-3的表达均比对照组有明显减少（P〈0．05）。培养72h后Caspase-3的表达在黄芪多糖40μg／ml组为（44．90±1．18）％,较对照组[（52．47±1．95）％]有明显减少,差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论在体外无血清及细胞因子的培养体系中,一定浓度的黄芪多糖具有抑制造血细胞凋亡的作用。Caspase-3在造血细胞凋亡过程中起着重要的作用。     

生长抑素对人脐血CD34^＋细胞增殖能力的影响

目的探索生长抑素（SST）对造血干／祖细胞增殖能力的影响以及可能机制。方法采用免疫磁殊分选技术纯化人脐血CD34^＋细胞;SST孵育人CD34^＋细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT—PCR分析其受体亚型。结果在1×10^-6～1×10^-10mol／L浓度范围内,SST抑制人CD34^＋细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关（r=0．903,P〈0．01）。SST使CD34^＋细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加（P〈0．05）;人脐血CD34^＋细胞表达SST-3型受体。结论SST通过人脐血CD34^＋细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34^＋细胞的增殖、维持其干细胞特性。     

自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗肝硬变的临床疗效研究

目的观察自体细胞因子诱导杀伤细胞（CIK细胞）治疗HBVDNA阳性肝硬化患者的近期疗效。方法CIK细胞在体外培养前后以及回输体内后检测CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋、CD56^＋、CD25^＋细胞以及mDC和pDC。治疗肝硬化患者,比较治疗前后病毒学指标及肝脏功能的变化。结果培养结束以及回输体内后,CD3^＋细胞、CD3^＋CD8^＋细胞、CD3^＋CD8^＋细胞较培养前显著升高,mDC和pDC在回输后也明显增高,肝脏功能较治疗前有所好转。所有患者均能耐受治疗。结论CIK细胞可明显提高免疫效应细胞数量,具有一定的抗病毒效应作用,毒副作用低。     

应用自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗肝硬化对肝功能影响的研究

目的观察自体细胞因子诱导杀伤细胞（CIK细胞）治疗慢性HBV DNA阳性肝硬化患者对肝功能的影响。方法CIK细胞在体外培养前后以及回输体内后检测CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋、CD3^＋、CD56^＋细胞以及mDC和pDC。治疗肝硬化患者,比较治疗前后病毒学指标及肝脏功能的变化。结果培养结束以及回输体内后,CD3^＋细胞、CD3^＋CD8^＋细胞、CD3^＋、CD56^＋细胞细胞较培养前显著升高,mDC和pDC在回输后也明显增高,肝脏功能较治疗前有所好转。所有患者均能耐受治疗。结论CIK细胞可明显提高免疫效应细胞数量,具有一定的抗病毒效应作用,毒副作用低。没有加重肝脏损伤,而对于肝功能有一定的改善作用。     

人参三醇组甙对小鼠骨髓细胞体外诱导树突状细胞的影响

目的 研究人参三醇组甙对小鼠骨髓细胞体外诱导扩增树突状细胞的影响，为临床肿瘤治疗提供实验依据。方法 应用IL-4和GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5-7d，光镜下观察细胞形态学变化；培养至第5-6d，加入黑色素瘤（B16）冻融抗原继续培养1．2d，流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86。结果 用IL-4和GM-CsF培养3d可见细胞形态发生改变，细胞形状不规则，培养5．6天时，有刺状突起、拉长，为典型树突状细胞形态学特征；抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达，IL＋GM-CSF＋TNF-α组（68．32％。60．25％）及IL-4＋GM-CSF＋冻融抗原组（83．51％，75．89％）明显高于对照组（3．25％，4．37％）及单纯IL-4＋GM-CSF培养组（22．74％，27．49％）（P〈0．001），IL-4＋GM-CSF＋冻融抗原组及IL-4＋GM-CSF＋冻融抗原＋人参三醇组甙组（85．54％，78．96％）CD83表达高于IL-4＋GM-CSF＋TNF吨组，差异显著（P〈0．05）。结论 人参三醇组甙可以体外协同抗原负载诱导小鼠骨髓细胞的树突状细胞成熟。     

成体大鼠骨髓间充质干细胞的表型研究

目的文献报道大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）不表达CD45,而本实验中却发发现CD45高度表达,针对这一现象做初步分析：方法成体大鼠骨髓MSCs的分离培养,对原代、第3代和第6代细胞做流式细胞仪检测MSCs的表面标记物以及染色体分析。结果体外培养的大鼠骨髓MSCs呈长梭型、有突起,排列成旋涡状。流式细胞仪检测示原代细胞：CD29（99．9％）,CD90（48．5％）,CD45（996％）,CD34（202％）;第3代细胞：CD29（100％）,CD90（97．1％）,CD45（100％）,CD34（089％）;第6代细胞：CD29（99．7％）,CD90（99．6％）,CD45（99．7％）,CD34（0．49％）。上述3代细胞的染色体分析床细胞核型为二倍体。结论体外培养的成体大鼠骨髓MSCs同时表达CD29,CD90和CD45,不表达CD34。     

血小板生成素诱导胎肝CD34^+造血干／祖细胞增殖分化过程中周期蛋白表达的变化

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制，本研究观察了在体外液体培养体系中，胎肝源CD34^+造血干／祖细胞在血小板生成素（TPO）作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果表明：①经12天培养后，TPO使胎肝CD34^+细胞数从1&;#215;10^5个／ml增加到13．12&;#177;4．06&;#215;10^5个/ml，CD41^+细胞增加了95％，CD34^细胞下降了3％，大部分细胞的DNA倍性为2N，少数为4N，无＜4N巨核细胞：②在整个培养期间，周期蛋白B1表达逐渐增加，并保持在一个高水平上，培养后期，高水平的周期蛋白B1出现在GI期细胞上；③周期蛋白D1和D3表达先增加，培养后期细胞内水平下降，且以G2期细胞为主。本研究结果提示：①TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达，促进巨核细胞的增殖分化；②周期蛋白B1在G2＋M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2＋M期的水平下降可能导致了胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。     

再生障碍性贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿血细胞GPI-AP缺陷分析

目的：探讨外周血细胞糖基磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI－AP）缺陷与再生障碍性盆血（AA）和阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）的关系。方法：用REDQUANT CD55／CD59，CELLQUANTCD55／CD59试剂盒和流式细胞术测15例正常人，47例AA和42例PNH或AA－PNH综合征患者外周血细胞GPI－AP的表达，结果：47例AA中16例（34．04％）血细胞CD55和CD59表达不同程度降低，且缺陷细胞百分率明显你芋AA－PNH综合征和PNH患者（P＜0．01），结论：AA，AA－PNH及PNH患者外周血细胞存在不同程度的GPI－AP缺乏，缺陷细胞百分率检测可作为相关疾病诊断与转化的参考。     

前列腺癌患者调节性T细胞的表达及意义

目的探讨CD4^＋CD25^high调节性T细胞在前列腺癌患者外周血及肿瘤组织中的存在及其意义。方法检测45例前列腺癌患者外周血及肿瘤组织中CD4^＋CD25^high调节性T细胞的表达，并进一步检测CD4^＋CD25high调节性T细胞胞内FoxP3的表达。同时检测肿瘤来源的CD4^＋CD25^high调节性T细胞在体外的抑制功能。结果前列腺癌患者外周血及肿瘤组织中存在大量CD4^＋CD25^high调节性T细胞，正常供者外周血中CD4^＋CD25^T细胞的比例仅为（0．5±0．1）％，患者外周血为（2．3±0．7）％，两者比较，P〈0．01；患者良性组织CD4^＋CD25^highT细胞的比例也显著低于恶性肿瘤组织[分别为（6．9±0．8）％和（11．3±1．3）％，P〈0．05].结论CD4^＋CD25^high调节性T细胞可能有助于肿瘤的生长，提示抑制或清除CD4^＋CD25^high调节性T细胞可能为前列腺癌的治疗提供新的途径。     

21例重型再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞检测及临床意义

目的：检测重型再生障碍性贫血（SAA）患者CD34^＋细胞骨髓单个核细胞比例,了解再生障碍性贫血发病与造血干细胞、祖细胞的关系。方法：应用流式细胞仪检测21例重型再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞表达水平。并与对照组比较。结果：再生障碍性贫血组21例患者CD34^＋细胞比例为（0．196±0．164）％,对照组10例患者CD34^＋细胞比例为（1．129±0．570）％,两组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：再生障碍性贫血患者CD34^＋细胞表达明显减少,支持再生障碍性贫血造血干细胞内在缺陷的发病学说。此检测有助于再生障碍性贫血诊断,值得临床推广。     

东阿阿胶对体外培养的癌症放疗病人外周血淋巴细胞的影响

目的观察东阿阿胶对体外培养的癌症放疗病人外周血淋巴细胞的影响。方法SD大鼠东阿阿胶灌胃给药3d后取血制备含药血清；取放疗病人外周血，经淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，接种于96孔培养板，东阿阿胶含药血清按分组刺量加入培养孔中，阳性对照为胸腺肽，37℃，5％CO2培养一定时间后，上流式细胞仪测定增殖率、T淋巴细胞活化抗原的表达、淋巴细胞表型及Th1／Th2细胞的比例。结果与对照组相比，不同剂量含东阿阿胶血清均能显著促进丝裂原诱导的淋巴细胞增殖．促进淋巴细胞活化，提高CD3^＋（T细胞）、CD3^＋CD56^＋CD16^＋（NK细胞）的比例和CD3^＋CD4^＋／CD3^＋CD8^＋比值，增加Th1，降低Th2。结论东阿阿胶能解除或减轻肿瘤和放疗对免疫系统产生的抑制作用，有助于免疫细胞对肿瘤的应答。     

人脐血CD34+造血干细胞的分离和体外扩增培养问题

目的通过细胞形态学观察以及计数法对分离得到的脐血CD34+造血干细胞进行研究,掌握脐血CD34+造血干细胞的生长规律和体外培养方法。方法采用Isolex50免疫磁珠法分离纯化脐血CD34+造血干细胞。在体外扩增培养中,将细胞因子SCF、IL-3、IL-6、G-CSF、EPO组合成不同实验组进行诱导,以检测单个核细胞数和集落形成单位(CFU)的形成率来找到细胞培养较好的细胞因子组合。结果本研究中使用细胞因子的细胞培养孔的单个核细胞数明显大于无细胞因子的细胞培养孔,使用此5种细胞因子联合对脐带造血干细胞培养效果最好。结论研究结果表明,不同的细胞生长因子组合会对培养CD34+造血干细胞产生不同的作用效果,对单个核细胞的增殖与扩增有明显的促进作用。     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。     

脐带间充质干细胞治疗再生障碍性贫血18例临床研究

目的 初步观察脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSC）治疗再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）患者的疗效和安全性.方法 18例AA患者,中位年龄28（7～49）岁,重型AA 10例,非重型AA 8例;7例曾接受免疫抑制治疗,均无效.从正常足月分娩胎儿的脐带分离培养UC-MSC,静脉输注给患者,每次输注细胞数为1×106/kg,每周输注1～2次.观察治疗前、后患者外周血细胞计数、骨髓细胞学、骨髓活检、外周血CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T淋巴细胞亚群比例及临床症状等,观察治疗相关不良反应.结果 18例患者接受UC-MSC输注中位次数38 （12～96）次,中位治疗时间8（3～16）月,中位随访时间31 （6～36）月.其中3例患者基本治愈,7例缓解,1例明显进步,2例患者贫血和出血症状好转、输血间隔延长,5例无效;总有效率72.2％.7例既往对免疫抑制剂无效的患者中,4例有效.12例患者在治疗前外周血CD4＋/CD8＋细胞比值倒置,治疗后11例不同程度升高（其中7例恢复正常）.所有患者均未出现明显的治疗相关不良反应.结论 UC-MSC治疗有助于改善AA患者的骨髓造血功能,短期观察未发现不良反应,尤其对免疫抑制治疗无效、不适合移植或不能耐受相关副作用的AA患者具有重要的临床价值.     

骨髓增生异常综合征CD34阳性细胞的免疫表型特征

目的 探讨骨髓增生异常综合征（1VlDS）患者CD34阳性（CD34^＋）细胞免疫表型特征。方法 应用一组系列相关单克隆抗体和四色流式细胞术二次设门策略，对20例IVIDS患者的骨髓细胞悬液CD34^＋｜细胞进行免疫表型分析。结果 随着MDS的进展[难治性贫血／难治性贫血伴环状铁粒幼细胞→难治性贫血伴原始细胞增多→转化型原始细胞增多性难治性贫血（RA／RAS→RAEB→RAEBT）]，在原始细胞群中的CD34^＋细胞比例逐渐增高（7．6％→40．1％→71．3％），各亚型之间有显著性差异（P〈1．05）。在CD45VSCD34散点图上二次设门取CD34^＋原始细胞行抗原表达的分析，异常表达HLA-DR及髓系抗原CD13、CD33和CD117、CD15比例减低。CD34在各亚型问有显著性差异（P〈0．05）。结论 二次设门策略能反映IVIDS原始细胞的免疫表型特征。     

脐血造血细胞扩增后细胞成分的变化

目的　探讨人脐血造血细胞体外扩增细胞数量和质量的变化及收获的最佳时机。方法　用重组人白细胞介素 - 3(rh IL- 3)、粒单集落刺激因子 (GM- CSF)和重组促红细胞生成素 (rh EPO)长期培养人脐血单个核细胞 ,动态观察其细胞构成和集落生成能力。结果　培养 1周后细胞总数逐渐增多 ,3周末细胞总数最多 ,扩增倍数为 (8± 4)倍 ,细胞构成则以髓系细胞为主 ;淋巴细胞 (CD3+ 、CD19+ )培养 1周明显下降 ,2周后低水平维持 ;培养 2周时 CD34+ 细胞百分比最高 ,为 (2 .4± 0 .7) % ,培养 3周时 CD34+ 细胞扩增倍数最大 ,为 (30± 7)倍 ,其中CD33+ CD34+ 细胞扩增倍数为 (4 5± 5 )倍。 CD71+ 细胞以培养 2周时最多 ,最高为 (5 1± 8) % ;CD42 a+ 细胞培养 3周时最高 ;单位数量细胞集落生成能力培养 ,1周时最大 ,但总的集落生成能力第 3周时最大。结论　含有上述生长因子的培养体系主要扩增脐血造血细胞的髓系细胞 ,次要扩增红系、巨核系细胞 ,最佳扩增时机为 3周。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

脐血造血祖细胞体外培养及脐血清对其影响的观察

应用单层琼脂体外培养法观察了脐血、成人骨髓及成人外周血ＣＦＵ—ＧＭ生长情况，并观察了脐血血清对脐血和成人骨髓ＣＦＵ—ＧＭ形成的影响。结果脐血７天ＣＦＵ—ＧＭ集落产率与成人骨髓相当，而明显高于成人外周血，并有散在成纤维细胞生成，可自发形成红系集落形成单位（ＣＦＵ—Ｅ）。培养到１４天，脐血ＣＦＵ—ＧＭ集落增多、曾大、呈巨大型。表明脐血不仅富含造血细胞，且造血细胞更原始。在培养体系中加１０％脐血血清后，脐血和成人骨髓ＣＦＵ—ＧＭ产率均增多，集落增大，集落中细胞数可高达数千，表明脐血血清中有造血刺激物存在。作者认为胎盘血循环实际上是—个髓外造血场所，脐血造血细胞有望作为—种骨髓造血重建的干／祖细胞来源而用于移植。     

人脂肪间充质干细胞分离培养及其生物学特性的实验研究

目的探索人脂肪间充质干细胞（adipose tissue—derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分离培养的方法及体外扩增的条件，观察ADMSCs的生物学特性。方法以腹部手术患者皮下脂肪组织为材料，采用I型胶原酶消化法及贴壁法分离培养ADMSCs，在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中贴壁培养，倒置显微镜观察，流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106的表达，透射电镜及扫描电镜下观察ADMSCs超微结构，流式细胞仪测定细胞周期。结果原代和传代细胞呈梭形外观，生长增殖能力良好。CD29、CD44、CD105均呈阳性表达，阳性率分别为95.3％、98．6％和86．5％；而CD31、CD34、CD106阳性率分别为3．5％、2．6％、1．3％。透射电镜观察显示ADMSCs表现出早期幼稚细胞形态的特点，流式细胞仪检测显示84．8％的细胞处于G0/G1期。结论酶消化法能有效地从人脂肪组织分离培养人ADSCs，细胞生长稳定，增殖能力活跃，为今后ADMSCs的分离培养提供了更简单有效的方法。