蜂毒素体外抑制内皮细胞血管生成及其作用机制

目的:探讨蜂毒素对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成的抑制作用及其机制.方法:体外培养ECV304细胞,分别测定蜂毒素对其增殖、迁移及形成管状结构的影响.采用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量.应用实时荧光定量PCR方法检测ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达.结果:经蜂毒素作用后,ECV304细胞的增殖明显受到抑制,24,48,72 h的IC50分别为5.11,4.68,4.40 mg/L.蜂毒素低、中、高浓度组和沙利度胺(TLD)组ECV304细胞迁移数目(19.44±6.54),(11.17±2.85),(4.22±1.83)和(18.28±5.29)个,明显低于空白对照组(42.33±9.63 )个(P＜0.01).蜂毒素低、中、高浓度组及TLD组形成管状结构的面积分别为 (5947.22±973.72),(1558.33±281.06),(705.85±318.01)和(2928.92±735.67) μm2/视野,均低于空白对照组(7828.94±1202.54) μm2/视野(P＜0.01).经蜂毒素处理后,ECV304细胞分泌VEGF及bFGF的功能明显下降.荧光定量PCR证实,蜂毒素可降低ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRN的表达.结论:体外实验结果表明,蜂毒素具有抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与血管内皮细胞VEGF和bFGF的活性降低及其合成受到抑制有关.     

内源性肿瘤血管生成抑制物的研究进展

血管生成抑制物是目前肿瘤研究中的热点。其中内源性肿瘤血管生成抑制物是人体内源性蛋白的一部分，在控制肿瘤的生长和转移过程中发挥重要作用，其生理毒性小、不会产生耐药性，有着较好的抗癌前景。作者就内源性肿瘤血管生成抑制物的产生、结构、作用机制和临床应用等方面作一综述。     

人神经菌毛素1 b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用

目的：制备抗人神经菌毛素1（human neuropilin 1,HuNRP1）b结构域单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAb）,为靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。方法：运用杂交瘤技术,将HuNRP 1 b结构域重组蛋白（TF-HuNRP1b）免疫BALB/c鼠,共免疫3次,取免疫鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,采用间接免疫荧光法（immunofluorescent assay,IFA）筛选稳定分泌抗HuNRP1b mA,以Western blot、IFA、流式细胞术分析mAb的特异性。以MTT法及小室迁移实验分析mAb抑制血管生成的能力。结果：获得1株稳定分泌抗HuNRP1b mAb的细胞株4F11。Western blot结果表明,本研究所获得的mAb 4F11只与重组HuNRP1b发生反应,与对照蛋白不发生反应;IFA及流式细胞分析结果表明,所获得的mAb能够识别肿瘤细胞MDA-MB-231、HepG2以及人脐静脉内皮细胞表达的天然HuNRP1蛋白;MTT法及小室迁移实验表明,所获得的mAb 4F11具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的能力。结论：成功制备出抗HuNRP1b的mAb,该mAb的获得将为进一步研究HuNRP1的功能及靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。     

脑特异性血管生成抑制因子的研究进展

在成人多数正常组织中.血管生成促进因子和抑制因子处于相对平衡的状态.如果这一平衡被打破就可能导致生理性(如伤口愈合)或病理性(如肿瘤)血管生成.     

血管生成抑制因子及血管生成抑制疗法

文中介绍了恶性肿瘤的发展与新血管生成的关系和血管生成抑制因子的研究进展,重点是目前最有效的一种抑制内皮细胞增殖的特异性血管生成抑制内皮抑素,这种蛋白分子能抑制原发和转移肿瘤,耐受性好且无毒性,也可用于治疗其他与血管生成相关的疾病。     

血管生成抑素的原核表达及纯化

目的：构建血管生成抑素（angiostatin)的原核表达载体。并转入大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化。方法：设计引物扩增angiostatin的cDNA,然后亚克隆入原核表达载体pET32a,并转化入大肠杆菌BL21中诱导表达。结果：通过重组质粒酶切和测序分析等方法,筛选出重组阳性克隆,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达,并纯化成功。结论：通过构建的原核表达。获得了纯化的angiostatin蛋白。     

血管生成素2与肿瘤血管生成

肿瘤血管是为肿瘤细胞输送氧气及营养物质的通道,也是实现肿瘤转移的重要通道之一。新近发现血管生成素(Angiopoietin,Ang)在血管新生中作用显著,尤其是血管生成素2(Angiopoietin-2,Ang-2),特异表达于肿瘤边缘的血管重建区,参与肿瘤血管新     

血管生成抑制素治疗血管瘤的研究

目的：观察血管生成抑制素治疗血管瘤的效果。方法发酵毕赤酵母工程菌组成型表达重组血管生成抑制素,用SP-Sepharose Fast Flow (阳离子交换剂)柱进行蛋白纯化;通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成试验和诱发血管内皮细胞凋亡试验,分析重组血管生成抑制素的生物学活性,在血管瘤模型(公鸡肉垂)中注射血管生成抑制素,分析血管生成抑制素对血管瘤的药效。结果血管生成抑制素在毕赤酵母中高效表达,经过纯化,收获达98%的重组血管生成抑制素;重组血管生成抑制素具有抑制CAM血管生成和诱发血管内皮细胞凋亡的活性;重组血管生成抑制素与血管瘤模型作用14 d后,瘤体血管生长抑制率为51%(P<0.01),血管瘤增殖抑制率为39%(P<0.05)。结论成功制备重组血管生成抑制素药物,血管生成抑制素对于血管瘤模型具有显著的药效。     

人血浆来源血管抑素的分离与纯化

血管抑素（angiostatin，AGN）是1994年O’Reilly等学者从荷瘤小鼠的血清和尿液中首次提纯出来的一种相对分子量为38KD的多肽类物质，具有抑制新生血管生成的作用，命名为血管抑素。随后发现人体内同样存在这种大分子活性物质，即可以通过酶降解纤维蛋白溶酶原得到血管抑素。     

人血管抑素的分离纯化及对不同细胞体外增殖的影响

目的：探讨人血管抑素（angiostatin)对不同细胞体外增殖的影响。方法：用亲和层析、分子筛技术及有限酶解法从人血浆组分Ⅲ中分离纯化得到人血管抑素（human angiostatin,以下简单称angiostatin)，采用MTT法分别分析angiostatin24h,48h,72h原培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)不同剂量angiostatin（20nmol/L,40nmol/L,80nmol/L,160nmol/L,320nmol/L及640nmol/L作用下HUVEC和小鼠肺动脉内皮细胞（1H11）、angiostatin为160nmol/L时其他细胞（7721、Hela,A431,A549,H128,K562,LIC,SL7,3T3)体外增殖的抑制率；透率电镜下观察angiostatin作用后1H11细胞形态的变化。结果：纯化的angiostatin能特异地抑制HUVEC细胞的体外增殖，且呈现一定的剂量和时间依赖性，HUVEC对angiostatin的敏感性高于1H11（P＜0．05）；对其他细胞株的体外外增殖无影响，透射电镜可见1H11内皮细胞出现典型的凋亡的形态学改变。结论：人血浆组分Ⅲ来源的angiostatin能特异地显著抑制内皮细胞的体外增殖，其作用机制之一是诱导内皮细胞凋亡。     

重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法：利用RT-PCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段,将其克隆到pCR-Blunt Ⅱ-TOPO载体和pcDNA3.1（＋）表达载体,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1-hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC-7721对其表达状况进行检测. 结果：所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1-hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1-hANG的人肝癌细胞SMMC-7721表达了血管抑素. 另外,从生长曲线结果来看,转染pcDNA3.1-hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC-7721和未转染的SSMC-7721细胞的生长速度无明显差别. 结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC-7721肝癌细胞,为开展下一步的实验奠定了基础.     

RKIP的克隆、表达及其影响肿瘤细胞迁移性质的初步研究

目的:研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)在细胞外对肿瘤细胞迁移的影响.方法:通过PCR扩增得到RKIP基因片段,使用BamH I和HindⅢ双酶切并回收,然后插入双酶切过的原核表达载体pET28a(+),得到pET28a-RKIP重组质粒.将重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经Ni+金属螯合层析纯化得到His-RKIP重组蛋白.通过伤口愈合实验,观察不同浓度的重组RKIP在细胞外对肿瘤细胞迁移的影响.结果:重组RKIP获得了高效表达和分离纯化,伤口愈合实验表明,在低浓度重组RKIP作用下A549肿瘤细胞迁移速度增加,在高浓度下肿瘤细胞迁移速度降低.结论:重组RKIP在细胞外具有促进和抑制A549肿瘤细胞迁移的双重作用,具体表现为低浓度时促进A549肿瘤细胞迁移,高浓度时抑制A549肿瘤细胞迁移.     

鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达

目的：构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法：采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果：酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论：真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。     

一种具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋白的纯化与N端氨基酸序列分析

目的分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的半夏蛋白,分析其对胰蛋白酶的抑制活性、抑制机制与N端氨基酸序列。方法采用以胰蛋白酶为配体的亲和色谱和Sephadex G-50凝胶过滤法,从半夏蛋白粗提液的40%(NH_4)_2SO_4沉淀中分离纯化活性半夏蛋白;采用12%SDS-PAGE鉴定其纯度,并估算其相对分子质量;采用Ed-man降解法分析其N-端氨基酸序列。结果纯化的活性半夏蛋白经SDS-PAGE检测呈现单一条带,相对分子质量为1.4×10～4;比活力为1059.012U/mg,活力回收率为24.40%;对胰蛋白酶的质量抑制比为1:4.72,抑制常数(Ki)为7.17×10～(-6)mol/L;其N端前6个氨基酸残基顺序为DPVVDG。结论该活性半夏蛋白是一种丝氨酸蛋白酶抑制刺,为胰蛋白酶的竞争性抑制剂。     

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人era基因（简称hera)进行表达、纯化。方法 PCR扩增hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C,重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌,用IPTG进行诱导表达。然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化。结果 克隆了hera基因,测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因,表达量占细菌总蛋白的59．6％。融合蛋白在菌体内主要以包涵体形成存在,在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白,其纯度达到了98．0％。结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因。并对融合蛋白进行了初步纯化。     

血管抑素基因对肿瘤治疗的研究进展

目的介绍血管抑制素在肿瘤治疗中的应用进展.方法复习国内外文献,从血管生成在肿瘤中的作用,血管抑制的生物效应、体内分布与生成以及抗肿瘤作用的研究进展等方面进行了较为详细的论述,并作了展望.结果血管抑制素基因对肿瘤的治疗是一种很有前途的抗肿瘤策略.结论研究一种高效稳定的血管抑素基运载系统是更好发扬其抗肿瘤作用的保证.     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

Purification and identification of natural antikeratin autoantibody from normal human sera and its effects on the cultured keratinocytes

Objective: To purify the natural antikemtin autoantibody (AK auto-Ab) and observe its effects on the proliferation of the cultured keratinocytes. Methods: Natural AK auto-Ab was purified by using keratin affinity column, and then the titre and specificity of the Abs were studied by ELISA, immunoperoxidase staining and immuno-electronicmi-croscope. The effect of the purified Abs on the cultured keratino-cytes was assayed by ^3H-TdR incorporation. Results:Natural AK auto-Ab was obtained. The binding activity oflgG AK auto-Ab in purified Ab remained similar to that in pooled human sera, and the specificity of the obtained antibody is strong. The purified antibody could decrease the ^3H-TdR incorporation of the cultured keratinocytes in a dose-dependent manner. Conclusion: The method of purifying AK auto-Ab is simple, practicable and reliable. Natural AK auto-Ab, existing in normal human individuals, has inhibitory effect on the proliferation of the cultured keratinocytes.