结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

结核分枝杆菌Rv3245 蛋白抗原免疫学特性的研究

目的:研究结核分枝杆菌Rv3425 蛋白免疫学特性,评估其诊断应用价值及在结核致病性中的作用。方法:将Rv3425 基因克隆至pET28a 载体中,诱导表达Rv3425 融合蛋白并进行纯化;利用ELISA、Western blot 分析其抗原性与特异性;流式检测该抗原对巨噬细胞凋亡的影响。结果:获得了可溶性原核表达融合蛋白Rv3425,Rv3425 蛋白能刺激灭活结核分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生高水平的特异性IFN鄄酌、纯化的Rv3425 蛋白能与结核感染小鼠血清特异性结合,其特异性血清抗体IgG 及IgM 在结核病人中的水平明显高于健康人,发现该蛋白能诱导巨噬细胞的凋亡。结论:本研究发现结核分枝杆菌Rv3425 蛋白具有较强的抗原性且能促进巨噬细胞的凋亡,这些发现对于结核病的诊断及致病机制的研究具有重要价值。     

结核分枝杆菌重组MPT64蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

结核菌素纯蛋白衍生物 (ＰＰＤ)含多种蛋白成分 ,与多种分枝杆菌存在交叉 ,尤其在鉴别结核菌感染和卡介苗接种阳转者上有一定的困难 ,所以ＰＰＤ作为结核病诊断试剂有其局限性。现已发现结核分枝杆菌Ａｇ85、ＭＰＴ64、38ｋＤ抗原、ＭＰＴ63、ＥＳＡＴ6等 ,均能诱发豚鼠发生迟发性超敏反应[1] 。具有高特异性的新的诊断试剂或许就存在于他们或他们的组合中。ＭＰＴ64蛋白是结核分枝杆菌生长过程中的分泌蛋白 ,它能诱发结核分枝杆菌感染的豚鼠发生很强的ＤＴＨ反应 ,部分ＢＣＧ在减毒过程中丢失了编码该蛋白的基因 ,特异性较强 ,用于皮肤试验…     

结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白的制备和应用

<正>全球结核杆菌感染者高达20亿人,每年新发病例约800万~1000万,其中我国每年新发患者高达150万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏感染是一种亚临床状态,其中约有10%的结核分枝杆菌潜伏感染者会发展成为结核病患者[1]。流行病学调查显示,我国受结核杆菌感染人数超过     

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白16.3蛋白的原核表达及功能检测

目的进行结核分枝杆菌小分子热休克蛋白MTB Hsp16.3原核表达载体的构建、表达、纯化并初步观察其生物学效应。方法提取临床H37Rv分离株基因组DNA,PCR扩增Hsp16.3基因,将其重组到原核表达载体Pet28a中,构建原核表达载体Pet28a-Hsp16.3,进行双酶切及测序鉴定。将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE检测,同时通过镍柱纯化试剂盒纯化Hsp16.3,测定纯化后蛋白浓度,并进行Western blot法检测。将不同浓度纯化后蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测巨噬细胞IL-10和IFN-γ的表达,同时设定空白对照组及阳性对照组。结果成功构建重组质粒Pet28a-Hsp16.3,并在E.coli BL21(DE3)中获得成功表达,通过镍柱纯化系统得到纯化Hsp16.3融合蛋白。qRT-PCR检测结果显示,不同浓度纯化后Hsp16.3蛋白作用小鼠腹腔巨噬细胞,可促进IFN-γ的产生而抑制IL-10的产生。结论成功克隆、表达和纯化了MTB Hsp16.3蛋白,Hsp16.3能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-γ,抑制IL-10的产生。     

结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列,定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒,将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌,构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌,其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染,重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO(一氧化氮)的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。     

结核分枝杆菌的ESX致病系统和EspR蛋白

近几年,结核分枝杆菌卷土重来,再次成为威胁人类健康的致病菌之一。尽管很多ESX系统的致病因子和毒力因子被研究发现,但迄今为止,结核分枝杆菌致病机制仍然不是很清楚。EspR(Rv3849)蛋白的研究可能为结核病的预防及治疗提供新的策略。     

1例非结核分枝杆菌肺病分析

1 临床资料 患者曹某某,男,57岁,因“咳嗽、咳痰6余年,加重伴喘息、气促1余年”于2014年4月2日入院.6余年前,患者无明显诱因出现咳嗽、咳白色粘痰,病情与季节变化无关,不伴发热、寒战、咯血,无胸闷、胸痛、双下肢水肿等,未予重视.5余年前,因上述症状无缓解,多次到当地医院及疾控中心就诊,诊断为“双肺结核”,长期服用抗结核药(异烟肼300mg qd,利福平450mg qd,乙胺丁醇750mg qd,前3个月加用链霉素),症状缓解不明显.1余年前,患者上述症状加重,夜间为甚,伴活动后喘息、气促,上一层楼即感呼吸困难,无发热、寒战、胸痛及双下肢水肿,多次到当地医院输液治疗(具体不详),症状无明显缓解.     

检测结核分枝杆菌蛋白抗原b夹心ELISA的建立及其应用

目的 建立定量检测脑脊液中结核分枝杆菌蛋白抗原b的夹心ELISA,以便用于诊断结核性脑膜炎.方法 制备抗结核分枝杆菌蛋白抗原b鼠源性单克隆抗体(mAb)及兔多克隆抗体;以单克隆抗体为包被抗体,多克隆抗体为检测抗体,建立检测结核分枝杆菌蛋白抗原b的双抗体夹心ELISA;应用此方法检测正常人(n=6)、非结核性脑膜炎患者(n=26)及临床确诊结核性脑膜炎患者(n=42)的脑脊液标本中蛋白抗原b的含量,并分析其与结核性脑膜炎活动性感染的相关性.结果 成功建立了检测蛋白抗原b的夹心ELISA,敏感度可达0.4 μg/L.应用该方法在正常人及非结核性脑膜炎患者脑脊液中未检测到蛋白抗原b;在结核性脑膜炎患者脑脊液中蛋白抗原b含量显著升高.结论 建立了敏感、特异检测结核分枝杆菌蛋白抗原b含量的ELISA,为活动性结核性脑膜炎的诊断提供一种有效手段.     

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化E.coli BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。     

表达结核分枝杆菌融合蛋白的DNA疫苗构建及免疫保护

目的评价构建的结核DNA疫苗pVS3in1免疫的小鼠体外产生细胞因子能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。方法将结核菌mtb8.4、Mr38 000和ag85b插入pVAX1载体,构建表达结核菌Mtb8.4-Mr38 000 CTL表位-Ag85B融合蛋白的DNA疫苗pVS3in1。将雌性C57BL/6小鼠分成5组,每组20只,分别用pVS3in1、pVAX1、pIL2S和PBS免疫3次,每隔2周。另一组用BCG(105CFU)皮内免疫1次。每组10只鼠在最后1次免疫后,培养脾细胞,检测上清液细胞因子。另10只用结核菌H37Rv经静脉攻击,2周后取脾、肝和肺培养结核菌并计数。结果pVS3in1组鼠脾细胞培养上清液mIL-2和mIFN-γ含量分别为(379.6±58.2)pg/mL和(529.7±63.7)pg/mL,显著高于3个阴性对照组(P<0.001),与BCG组无显著性差异(P>0.05)。5组的mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS3in1组的脾、肝和肺结核菌载量分别为(17 443.6±3 202.5),(19 047.2±3 395.5)和(14 822.2±2 882.2)CFU/g,低于pVAX1、pIL2S和PBS等3组相应器官的载量(P<0.001),仅脾菌落数显著高于BCG组。结论pVS3in1能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答,诱导小鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG相当。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因重组卡介苗的构建与鉴定

目的ESAT-6是结核分枝杆菌的一种分泌性蛋白质,具有免疫保护作用,可作为抗结核病新疫苗的候选分子.而卡介苗由于缺失ESAT-6基因,不能产生该抗原蛋白.本研究旨在构建ESAT-6基因重组卡介苗,使其表达ESAT-6抗原,从而增强其免疫原性和免疫保护性,探索将该重组卡介苗用作新型结核病疫苗的可行性.方法分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,经PCR扩增得到BCGα-抗原(α-Ag)信号肽序列和结核杆菌ESAT-6基因,将ESAT-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME.再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME.最后通过电穿孔法将pSME导入卡介苗中,并用抗性筛选、PCR扩增及打点杂交进行鉴定.结果电转化后的卡介苗能在含10mg/L卡那霉素的培养基上生长.以重组卡介苗总DNA为模板的PCR扩增得到阳性扩增带,大小与α-Ag信号肽序列加上ESAT-6基因的长度一致.打点杂交中探针与重组卡介苗显示阳性信号.结论基因重组卡介苗构建成功,并有望分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6.该重组卡介苗既保留了卡介苗中原有的抗原,又增添了新的保护性抗原,且这种抗原可被广泛识别,能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆,因此ESAT-6重组卡介苗可能具有更好的免疫原性和保护力.本研究为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础.     

可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究

目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的制备

ＣＦＰ10和ＥＳＡＴ6都是结核分枝杆菌(Ｍ .ｔｂ)特有的、有良好抗原性的分泌性蛋白 ,将其编码基因 1ｈｐ和ｅｓａｔ6用ＧｅｎｅＳＯＥｉｎｇ法通过Ｌｉｎｋｅｒ (Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3构建成融合基因 ,并克隆入ｐＱＥ30质粒 ,表达、纯化、鉴定ｒＣＦＰ10 ＥＳＡＴ6 ,为其应用于Ｍ .ｔｂ感染的诊断和预防奠定基础。1 1ｈｐ ｅｓａｔ6基因的构建 :以已构建的ｐＱＥ30 ＣＦＰ10质粒为模板 ,用引物(Ｐ1) 5′ ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ 3′和 (Ｐ2 ) 5′ ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣ…     

结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的研制与初步鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌CFP-10蛋白的单克隆抗体(mAb).方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-lhp原核表达的融合蛋白His-CFP-10作为抗原免疫BALB/c小鼠,以纯化的融合蛋白GST-CFP-10作为检测抗原,制备抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb;采用间接ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性.结果:获得2株稳定分泌抗结核分枝杆菌CFP-10 mAb的杂交瘤细胞株6E8、2E7,其Ig亚类分别为IgG1、IgG2b.mAb 6E8、2E7腹水的ELISA效价分别为1:1 000 000,1:1 024 000.在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-CFP-10及GST-CFP-10的重组大肠杆菌反应,与其他5种菌株均不发生反应.在Western blot试验中,2株mAb只与CFP-10蛋白发生反应,出现特异性条带.结果表明,mAb 6E8、2E7是针对结核分枝杆菌CFP-10的特异性mAb.结论:成功地制备抗结核分枝杆菌CFP-10的mAb,它们在结核分枝杆菌诊断和致病机理研究等方面有重要应用价值.     

结核分枝杆菌免疫相关蛋白PPE68的表达及免疫原性的研究

目的：克隆、表达结核分枝杆菌PPE家族蛋白PPE68的编码基因Rv3873．并初步探索PPE68诱导Balb／c小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,为进一步研究PPE68的免疫功能提供实验依据。方法：以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv3873基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET32a（＋）,获得重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达,纯化表达产物,通过XTT比色法检测重组蛋白PPE68诱导脾淋巴细胞的增殖活性。结果：重组质粒pETRv3873构建成功．57kDa的His—PPE68融合蛋白在大肠杆菌中稳定表达,并具有刺激Balb／c小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。结论：PPE68蛋白具有较强的免疫原性,其免疫学功能具有进一步研究的价值。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的表达、鉴定及抗血清的制备

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,鉴定并纯化重组rPPE68蛋白后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PPE68多克隆抗体。方法将已经过鉴定的重组原核表达质粒pET32a(+)-PPE68转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导大量表达PPE68蛋白。对表达蛋白进行鉴定后利用亲和层析法进行纯化。以纯化后重组rPPE68为免疫抗原,与弗氏不完全佐剂等体积混合,采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔,于第3次免疫后的第7天采血。用凝集实验与Western-blot检测抗血清的特异性,并用双向免疫扩散法测定抗血清效价。结果在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量57 000处可见特异性条带,免疫印迹分析证实表达的目的蛋白可与结核分枝杆菌H37Rv株感染小鼠的血清发生反应。纯化的rPPE68蛋白免疫新西兰大白兔后,凝集反应与Western-blot证实了抗血清的特异性,双向免疫扩散法测得血清效价为1∶16。结论已成功表达结核分枝杆菌PPE68蛋白,制备了特异性兔抗PPE68多克隆抗体,对结核病的早期诊断提供了一种新的思路。     

Rab蛋白参与结核分枝杆菌胞内吞噬的研究进展

结核分枝杆菌(Mtb)是结核病的病原体,可通过调控细胞吞噬作用来促进胞内细菌的存活,并干扰宿主细胞的生理功能。Rab蛋白是胞内膜转运过程的重要组分,参与和调节了Mtb的吞噬过程。本文主要介绍Mtb及其菌体成分对胞内吞噬的影响,并就Rab蛋白在其中的作用进行论述,从而探讨Rab蛋白与Mtb胞内吞噬的关系,为进一步研究Mtb胞内免疫机制提供理论基础。     

结核分枝杆菌抗原Ag85B-Mpt64190-198-HspX融合蛋白免疫原性的初步观察

目的 为了建立对潜伏感染细菌的保护性免疫应答,本研究选择结核分枝杆菌休眠期、对数生长期最重要的保护性抗原HspX、Mpt64的190～198位的氨基酸多肽(CD8+T细胞表位)及Ag85B,构建融合蛋白Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH),并对其免疫原性进行研究.方法 PCR分别扩增Ag85B、Mpt64190-198-HspX基因,并依次插入pET-28a质粒中,在大肠杆菌BL21中表达纯化AMH蛋白.将该蛋白和佐剂二甲基三十六烷基铵和卡介苗多糖核酸(DDA+BCG-PSN)混合构建亚单位疫苗,分别于1、4、7周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,最后一次免疫5周后检测体液免疫与细胞免疫反应.结果 该融合蛋白以包涵体形式能在大肠杆菌中稳定表达,经Ni-NTA层析柱纯化得到纯度较高的蛋白;构建的亚单位疫苗免疫动物能产生针对结核杆菌特定抗原(PPD、Ag85B、Mpt64190-198和HspX)的特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 融合蛋白AMH作为结核亚单位疫苗候选的融合蛋白抗原有必要进一步研究.     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。