半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402的诱导凋亡作用

目的观察并比较半夏蛋白对体外培养的人肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用。方法应用流式细胞技术,检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402的诱导凋亡作用,并观察了其诱导凋亡作用的量-效关系。结果60%硫酸铵沉淀蛋白没有明显诱导Bel-7402细胞凋亡的作用,而30%硫酸铵沉淀蛋白有诱导Bel-7402细胞凋亡的作用。30%沉淀进一步分离结果显示,只有0.1 mol/L NaCl洗脱峰有一定诱导Bel-7402细胞凋亡的作用。结论半夏蛋白有一定的诱导Bel-7402细胞凋亡作用,其主要成分可能存在于总有机酸部位。     

半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402生长抑制作用的研究

目的:观察并比较半夏蛋白对体外培养人肝癌细胞Bel-7402生长的抑制作用.方法:应用MTT技术检测半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用,并观察其量效关系.结果:30%沉淀、60%沉淀及Tris-HCl洗脱峰的量效关系不明显,0.05M和0.1M NaCl的洗脱峰呈现较好的量效关系,且对Bel-7402细胞的抑制作用与空白对照组有显著性差异(P＜0.05).结论:层析后的半夏蛋白对体外培养肝癌细胞增殖有较好的抑制作用,呈现显著的量效关系.     

半夏类药材不同提取物对人肝癌细胞Bel-7402生长抑制作用的研究

目的:观察并比较半夏类药材的不同提取物对体外培养的人肝癌细胞Bel-7402的生长抑制作用。方法:应用MTT技术,检测半夏类药材不同提取物对人肝癌细胞Bel-7402的抑制作用。并观察了不同提取物抑制作用的量效关系。结果:所有乙酸乙酯提取的部位都有比较好地抑制Bel-7402细胞增殖的作用(P<0.01);乙醇提取部位有一定抑制作用(P<0.05);而所有石油醚提取部位都无明显作用。此外,乙酸乙酯和乙醇提取部分对肝癌Bel-7402细胞生长抑制作用,存在着显著的量效关系,其中以亳州掌叶半夏最为明显。结论:半夏乙酸乙酯和乙醇提取物有抑制体外培养肝癌细胞增殖的作用,呈现出显著的量效关系。     

沙枣对人肝癌Bel-7404细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察沙枣提取物对人肝癌Bel-7404细胞增殖抑制作用及其对细胞凋亡的影响。方法:以没食子酸为对照品,采用Folin-Ciocalteu法测定沙枣提取物各分离组分的总酚含量。通过MTT法,观察各组分对Bel-7404细胞增殖抑制作用。选取对Bel-7404增殖抑制活性最强的20%乙醇洗脱组分,设50、100、150μg/ml剂量组,采用Ainexin V-FITC/PI双染法,流式细胞仪检测其诱导细胞凋亡,并采用Hoechst 33258荧光染色法观察细胞形态变化。结果:沙枣提取物各分离组分对Bel-7404增殖抑制作用各不相同,其中20%乙醇洗脱组分的50、100、150μg/ml剂量组的凋亡率分别为29.8%、58.7%和76.2%;凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。结论:沙枣提取物可抑制Bel-7404细胞增殖,诱导其凋亡,并与总酚含量呈现一定的量效关系。     

走马胎生物转化产物S1的抗肿瘤活性及对Bel-7402肝癌细胞凋亡及细胞周期的影响

目的:研究走马胎中的生物转化产物S1对不同肿瘤细胞株增殖的影响,并检测S1对肝癌细胞Bel-7402凋亡及周期的影响。方法:利用燕麦曲霉对走马胎中的化合物Ag3进行生物转化,得到新的化合物S1。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT比色法)检测S1的抗肿瘤活性;筛选对S1较敏感的细胞株,观察细胞形态学变化、检测细胞凋亡和细胞周期。结果:S1作用于Bel-7402、MCF-7、A549等6株肿瘤细胞后的半数抑制浓度(IC50)范围为12.8~27.3μmol/L,其中Bel-7402细胞株对S1最为敏感。含S1培养基(终浓度为0、5、10、20μmol/L)干预Bel-7402细胞24h后,早期凋亡较明显,凋亡率分别为0.91%、3.13%、43.26%、71.34%,中、高剂量组凋亡最为明显,凋亡率具有明显的浓度依赖性,各剂量组与阴性对照组比较均有显著差异;S1将细胞阻滞于G2/M期,该期细胞明显增多,S期细胞明显减少,通过抑制细胞增殖达到抗肿瘤活性。结论:S1对6种肿瘤细胞株均有一定的抑制作用,对Bel-7402细胞的抑制作用较强,诱导Bel-7402细胞的凋亡机制可能与阻滞细胞周期相关。     

雷公藤甲素对人肝癌Bel-7402细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究雷公藤甲素影响人肝癌Bel-7402细胞增殖及凋亡的作用及机制。方法:采用细胞药理学实验方法,人肝癌细胞株Bel-7402与雷公藤甲素(10μg/mL、5μg/mL及0.25μg/mL)共培养,MTT法检测其对Bel-7402细胞增殖的影响,TUNEL技术检测其对Bel-7402细胞凋亡的影响,免疫组织化学(SABC)染色法检测Bax及Bcl-2蛋白表达。结果:作用48h后雷公藤甲素(10μg/mL、5μg/mL、0.25μg/mL)3个剂量对Bel-7402细胞增殖均有显著抑制作用,P<0.01,抑制作用随药物浓度增高而有加强趋势,最高抑制率可达38.67%,且呈量效关系,3个剂量组间有显著性差异,P<0.01。雷公藤甲素(10μg/mL、5μg/mL、0.25μg/mL)能有效诱导Bel-7402细胞凋亡,作用显著,P<0.01,且呈显著的量效关系。雷公藤甲素(10μg/mL、5μg/mL、0.25μg/mL)用药组Bax、Bcl-2表达与对照组比较,无显著性差异,P>0.05。结论:雷公藤甲素能抑制人肝癌Bel-7402细胞增殖和诱导其凋亡,其诱导Bel-7402细胞凋亡的作用机制可能不是通过Bax、Bcl-2途径。     

党参多糖分离鉴定及体外抗肿瘤活性的研究

目的 分离党参总多糖(CPS)并研究各分离组分的结构及体外抗肿瘤活性.方法 水提醇沉法提取CPS,DE - 52纤维素离子交换色谱法分离纯化得到CPS分离组分,MTT法、SRB法检测CPS及其分离组分体外抗肿瘤活性.高效凝胶渗透色谱法(GPC)测定各分离组分相对分子量.气相色谱法测定多糖分离组分单糖组成及摩尔比.结果 党参总多糖中分离得到两种新的党参多糖,包括CPS -3,分子量为1.24×106,由木糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1.17:0.96,对BGC - 823人胃腺癌细胞的增殖有抑制作用;CPS -4,由分子量为1.96×106、1.51×106的两种多糖组成,可抑制Bel- 7402人肝癌细胞增殖.结论 CPS中的组分CPS -3和CPS -4分别是CPS对BGC - 823人胃腺癌细胞、Bel - 7402人肝癌细胞起抑制作用的关键活性组分.     

绞股蓝总皂苷对人肝癌细胞Bel-7402增殖与凋亡的影响

目的:探讨绞股蓝总皂苷(gypenosides,Gyp)对人肝癌细胞Bel-7402增殖与凋亡的影响.方法:采用MTT法检测Gyp对体外培养的人肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制作用;单细胞凝胶电泳法检测Gyp对人肝癌细胞Bel-7402 DNA损伤的影响;RT-PCR技术从分子水平上检测Gyp对人肝癌细胞Bel-7402的诱导凋亡作用机制.结果:100 ～400 μg· mL-1的Gyp对人肝癌细胞Bel-7402增殖生长有抑制作用,Gyp(182 μg·mL-1)作用4,8,12,16,24 h后,单细胞凝胶电泳观测到DNA损伤,12h时DNA损伤最大,达到(81.15±14.23)％,且有时间依赖性;Gyp组细胞caspase-8大量表达,对照组细胞无表达.结论:Gyp能抑制人肝癌细胞Bel-7402增殖且促进其凋亡,其作用机制与DNA损伤以及caspase-8的大量表达有关.     

皂角刺抗肿瘤活性部位筛选

目的:研究皂角刺乙醇提取物及其不同溶剂萃取部分对肿瘤细胞的体外抑制作用,筛选皂角刺抗肿瘤活性部位.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法.结果:皂角刺乙醇提物、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对七种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用;乙酸乙酯部位对Bel-7402细胞、HeLa细胞和KB细胞的抑制作用较强.IC50值分别为122.67μg·mL-1、118.3μg·mL-1和145.91μg·mL-1;氯仿部位对Bel-7402细胞、HeL丑细胞和KB细胞的抑制作用次之,IC50值分别为189.66μg·mL-1、196.43μg·mL-1和191.77μg·mL-1;正丁醇部位对Bel-7402细胞、HeLa细胞和KB细胞的抑制作用较小;水溶性部位对所选细胞均无抑制作用.结论:乙酸乙酯部位有较好的细胞毒作用,初步确定为皂角刺抗肿瘤活性部位.     

犀黄丸诱导人肝癌细胞凋亡及其机制的研究

观察犀黄丸含药血清诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的作用,并对其机制进行初步的探讨,目的:研究犀黄丸含药血清诱导人肝癌Bel-7402细胞凋亡的作用,并对其机制进行初步探讨.方法:犀黄丸含药血清对肝癌细胞生长的影响,检测对肿瘤Bel-7402杀伤率.在用不同浓度犀黄丸含药血清作用Bel-7402细胞不同时间后,用TUNEL法检测凋亡,用SASB法检测细胞bcl-2、c-myc、p53蛋白表达.结果:犀黄丸含药血清能明显抑制Bel-7402细胞生长,其肿瘤细胞Bel-7402杀伤率最高达75%,与对照组比较有显著性差异(P＜0.01).TUNEL法显示,细胞凋亡率明显提高,与对照组比较有显著性差异;Bel-7402细胞的bcl-2、c-myc基因蛋白表达降低,而p53基因蛋白表达增强.     

半夏化学成分的研究

目的:研究传统中药半夏的化学成分。方法:用各种色谱技术进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据鉴定结构。结果:从半夏乙醇提取物的石油醚萃取部分分离鉴定了6个化合物:豆甾4烯3酮(stigmast4en3one)(Ⅰ),环阿尔廷醇(cycloartenol)(Ⅱ),5α,8α桥二氧麦角甾6,22双烯3醇(5α,8αepidioxyergosta6,22dien3ol)(Ⅲ),β谷甾醇3OβD葡萄糖苷6′O二十烷酸酯(βsitosterol3OβD glucoside6′eicosanate)(Ⅳ),α棕榈精(αmonpalmitin)(Ⅴ),β谷甾醇(βsitosterol)(Ⅵ)。经MTT实验表明:化合物Ⅲ对人肿瘤细胞株HCT8,Bel7402,BGC823,A549,A2780具有一定抑制作用。结论:化合物Ⅰ～Ⅳ均为首次从该植物中分离得到,其中化合物Ⅱ为首次从该属植物中分离得到的三萜类化合物,化合物Ⅲ可能为半夏抗肿瘤作用的有效成分之一。     

半夏总蛋白提取及其动态变化研究

目的优选出半夏总蛋白提取的最适方法并研究不同生长时期总蛋白量及成分的变化,为半夏药用成分的监控及合理采收提供科学依据。方法采用丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取半夏总蛋白,筛选半夏总蛋白提取的最佳方法。分别于半夏出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰苞期及倒苗期采集样品,分为新鲜组和干燥处理组,提取样品总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测及Bradford浓度测定。结果丙酮沉淀法、95%(NH4)2SO4盐析法、TCA-丙酮法和Tris-饱和酚法提取的半夏总蛋白量分别为0.369、0.678、1.082、0.493 mg/mL;新鲜半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期4.53 mg/g、全苗期2.28 mg/g、珠芽期2.79 mg/g、佛焰苞期7.61 mg/g、倒苗期10.21 mg/g;干燥半夏5个不同生长时期总蛋白量占块茎的质量分数分别为出芽期31.85 mg/g、全苗期18.52 mg/g、珠芽期42.08 mg/g、佛焰苞期28.56 mg/g、倒苗期56.84 mg/g;新鲜半夏块茎中蛋白含有15条蛋白带,干燥处理半夏块茎中蛋白含有5条蛋白带。结论 TCA-丙酮法是半夏总蛋白提取的最佳方法,不同生长时期的半夏块茎中蛋白成分各异,倒苗期总蛋白量最高。     

鲜半夏中抑制肿瘤坏死因子-α产生的活性成分

目的：研究半夏Pinellia ternata鲜块茎中的生物活性成分,为其质量评价提供科学依据。方法：采用多种柱色谱方法进行分离纯化,根据理化性质和谱学方法鉴定其结构。利用微孔板紫外吸收比色法,体外测定化合物对脂多糖(LPS)刺激的小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子TNF-α的抑制作用。结果：从半夏鲜块茎中分离得到9个化合物,分别鉴定为反式-对-香豆醇(1),3,4-二羟基桂皮醇(2),阿魏酸(3),落叶松脂醇(4),赤式-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-{2,6-二甲氧基-4-［1-(E)-丙稀-3-醇］-苯氧基}-丙烷-1,3-二醇(5),去氢二松柏醇(6),异落叶松脂醇(7),4-羟苯丙烯基-O-β-D-吡喃葡糖苷(8)和松柏苷(9)。化合物1,2,3,8和9在10-5 mol·L-1浓度对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的抑制作用分别为24.1%,57.6%,40.2%,82.7%和62.0%。结论：化合物1,2和4～8系首次从半夏属植物分离得到,化合物9系首次从半夏分离得到。化合物1,2,8和9为苯丙素类化合物,化合物4～7为木脂素类化合物。半夏的抗炎作用可能与化合物1,2,3,8和9有关。     

Differentiation of bel-7402 human hepatocarcinoma cells induced by aqueous extracts of fresh gecko (AG) and its anti-tumor activity in vivo

Ethnopharmacological relevance

Gecko, a kind of reptile, has been widely used as a traditional Chinese medicine to treat various diseases including cancer in China for thousands of years. The aim of this study was to investigate the anti-tumor effect of AG (aqueous extracts of fresh gecko) on human hepatocellular carcinoma cell Bel-7402 in vitro and mouse H22 hepatocellular in vivo. Further to underlie the molecular mechanism of AG inducing the differentiation of Bel-7402 cells.

Materials and methods

AG was obtained by water extracting method and qualitatively analyzed through High Performance Liquid Chromatography. The total protein concentration of AG was measured by BCA (bicinchoninic acid disodium) assay. The anti-tumor activities in vivo were analyzed through H22 (mouse hepatocellular carcinoma cell line H22) tumor xenografts mice. The cytotoxic activity of AG on Bel-7402 cells was evaluated by MTT assays. AFP (alpha fetoprotein) was detected by radioimmunoassay. ALB (albumin), ALP (alkaline phosphatase) and γ-GT (γ-glutamyl transpeptidase) were detected by biochemical methods with commercial kits. While morphological changes were observed through an inverted microscope. Moreover, the expression level of the proteins involved in MAPK (mitogen-activated protein kinase) signal pathway which was closely related to cellular differentiation was assessed by Western blot.

Results

AG showed obviously anti-tumor activity in vivo and anti-proliferative activity on Bel-7402 cells in vitro both dose-dependently. The number of clones of Bel-7402 cells treated with AG reduced and the cells were displaying differentiation state such as relatively bigger size and dispersed growth. The biochemical function markers of the cells were significantly changed after being treated with AG. The data showed that AFP secretion of the cells decreased 42.5%, ALB secretion increased 58.9%, the activity of ALP and γ-GT markedly decreased 67.0% and 48.5% separately when the concentration of AG was 10 μl/ml, and those effects were all in a dose-dependent manner. The major original and phosphorylated signal proteins (ERK1/2 (extracellular sigal-regualted kinase 1/2), P38 (p38 MAPK) and JNK1/2 (c-Jun N-terminal kinase 1/2)) involved in MAPK signal pathway were measured and the results showed that AG activated the ERK1/2 of Bel-7402 cells.

Conclusions

AG has anti-tumor activity in vivo and inhibits Bel-7402 cell proliferation in vitro through inducing cell differentiation, and the mechanism involves the activation of ERK1/2.     

多棘蜈蚣与少棘蜈蚣抗肿瘤作用研究

目的:探讨两种蜈蚣的抗肿瘤作用。方法:以MTT法测定两种蜈蚣的含药血清对人肝癌细胞系Bel-7402生长的抑制作用;体内试验将小鼠接种S180实体瘤后检测两种蜈蚣对小鼠S180实体瘤生长的抑制作用。结果:两种蜈蚣均可明显抑制肝癌细胞株Bel-7402的增殖;多棘蜈蚣和少棘蜈蚣0.2,0.4,0.6 g.kg-1对小鼠S180实体型肿瘤均有明显抑制作用(P<0.01),抑瘤率分别为60.95%,63.68%,69.01%和48.52%,50.18%,50.83%。结论:两种蜈蚣均具有较强的抗肿瘤作用,无论体内和体外试验,多棘蜈蚣均有优于少棘蜈蚣的趋势。     

齐墩果酸诱导人肝癌Bel-7402细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究

该研究旨在探讨齐墩果酸在诱导Bel-7402肿瘤细胞凋亡过程中,细胞周期分布的变化及其相关的分子机制。采用MTT法、台盼蓝拒染试验检测齐墩果酸对肝癌细胞增殖的抑制作用;PI单染检测细胞周期;Annexin V-FITC双染法观察细胞凋亡;Western blot法检测周期调控蛋白以及凋亡相关蛋白表达的变化。结果显示齐墩果酸能显著抑制Bel-7402肝癌细胞株增殖,G₂/M期的细胞比例显著升高,而G₁期细胞明显减少,明显增加细胞凋亡率;同时下调细胞周期蛋白cyclin B1,使蛋白磷酸酶Cdc25C(Ser216)磷酸化而失去活性、引起Cdk1(Tyr15)以及蛋白激酶Chk1的磷酸化水平升高。OA也可上调p21水平导致细胞周期阻滞在G₂/M期;此外Bcl-2表达减少,Bax,Cyt c表达增加,cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3蛋白表达增加。以上结果提示齐墩果酸能明显抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,可能是通过激活凋亡线粒体信号通路而实现的。     

Cinobufacini,an aqueous extract from Bufo bufo gargarizans Cantor,induces apoptosis through a mitochondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells

Aim of the study

Cinobufacini (Huachansu), an aqueous extract from the skin and parotid venom glands of Bufo bufo gargarizans Cantor, is a traditional Chinese medicine widely used in clinical cancer therapy in China. The present study sought to investigate the possible signaling pathway implicated in cinobufacini-induced apoptosis in the hepatocellular carcinoma cell lines HepG₂ and Bel-7402.

Materials and methods

The effects of cinobufacini on cell proliferation of HepG₂ and Bel-7402 cells were evaluated by 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assays. Cell apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining and flow cytometry analysis. The mitochondrial membrane potential (Δψm) and caspase-9 and -3 activity were detected using MitoCapture reagent staining and colorimetric assays, respectively. The expression of apoptosis-related proteins and release of cytochrome c were assessed by Western blot analysis.

Results

Cinobufacini significantly inhibited cell proliferation of both cell lines in a dose- and time-dependent manner. Marked changes in apoptotic morphology and apoptosis rates were clearly observed after cinobufacini treatment. The protein expression of Bax increased whereas that of Bcl-2 decreased, leading to an increase in the Bax/Bcl-2 ratio. Subsequently, cinobufacini disrupted the mitochondrial membrane potential (Δψm) and resulted in the release of cytochrome c, activation of both caspase-9 and -3, and cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).

Conclusion

The present study indicated that cinobufacini can induce apoptosis of HepG₂ and Bel-7402 cells through a mitochondria-mediated apoptosis pathway.     

南北方半夏居群相互引种的比较研究

 目的同时比较不同居群半夏在南、北方种植的质量,为半夏的选育和引种栽培提供理论依据。方法将采自不同产地的半夏分别随机种植在南方和北方基地,通过收获指数、含水量、总生物碱含量、综合指数等指标进行比较。结果在北方种植的不同居群的半夏在产量、干物质含量、生物碱含量上都好于南方;引自安岳、河北的半夏无论在北方还是南方收获指数和生物碱含量均较高,其次是潜江半夏。总体上,南方半夏引种至北方好于北方引种至南方。结论南方种源半夏引种至北方好于北方种源引种至南方。