内源性睫状神经营养因子对青光眼鼠视网膜的保护作用

目的 探讨睫状神经营养因子(CNTF)蛋白在慢性高眼压性青光眼大鼠视网膜中的定位及表达情况.方法采用水下电凝巩膜静脉建立大鼠慢性高眼压性青光眼模型,在1、3、7、14、28 d分别摘取眼球,运用免疫组织化学和Western blot法检测大鼠视网膜CNTF蛋白的定位及表达变化.结果对照组大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)层有少量CNTF蛋白表达,青光眼大鼠视网膜CNTF蛋白的表达显著增加,建立模型后第7～14 d表达量达到高峰,此时除了神经节细胞层外,内外核层亦发现有CNTF蛋白的表达,之后表达减少.结论青光眼大鼠视网膜内源性CNTF表达增加,可能与促进损伤的RGCs的存活和轴突再生密切相关.     

大鼠视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα mRNA的表达

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子及其受体在大鼠视网膜中的表达变化。方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1、3、7、14、28d取眼球,以正常大鼠视网膜为对照,提取视网膜组织RNA,运用RT-PCR检测视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA的表达变化。结果在正常视网膜中存在CNTF和CNTFRαmRNA的表达,视神经损伤后CNTF和CNTFRαmRNA表达量逐渐增加,第7d达到最高,第14d下降,具有统计学意义(P<0.01)。28dCNTF表达仍高于正常组(P<0.01)。结论视神经损伤刺激了视网膜细胞表达CNTF和CNTFRα增加,可能是视网膜神经元自我保护的一种反应。     

大鼠视神经损伤及修复过程中视网膜睫状神经营养因子mRNA的表达

目的 探讨大鼠视神经损伤及修复过程中睫状神经营养因子（CNTF）mRNA在视网膜上的表达及意义。 方法 35只健康雄性SD大鼠，随机取5只作为正常对照组；另两组为视神经单纯切断组和视神经-坐骨神经吻合组，每组各15只大鼠。建立大鼠视神经单纯切断和神经-坐骨神经吻合模型，分别于建立模型后3、7、14 d取视网膜组织，应用半定量逆转录-聚合酶链反应方法观察正常大鼠及各模型大鼠视网膜上CNTF mRNA的表达情况。 结果 在正常大鼠视网膜上，CNTF mRNA有微量表达，视神经单纯切断后其表达增加（3、7、14 d CNTF mRNA的表达分别增加100%、594%和485%），视神经切断并吻合一段坐骨神经后，表达增加更明显（3、7、14 d CNTF mRNA的表达分别增加258%、752%和515%）。 结论 视神经损伤后，可通过提高内源性CNTF来应答视网膜神经节细胞（RGC）轴索反应，保护RGC，为外源性CNTF的应用提供理论依据。 （中华眼底病杂志，2004，20：355-357）     

急性高眼压大鼠视网膜RhoA的分布及表达

目的:探讨急性高眼压大鼠视网膜RhoA的分布及表达变化。方法:将56只SD大鼠随机分成正常对照组、急性高眼压后1,3,7d共4组,用免疫组化和半定量RT-PCR方法检测大鼠视网膜组织中的RhoA的分布及表达情况。结果:正常及急性高眼压后1d,RhoA主要分布于视网膜神经纤维层及神经节细胞层;3d分布于神经节细胞层及内丛状层;7d分布于神经节细胞层、内丛状层、内核层及外丛状层。半定量RT-PCR提示:在正常大鼠视网膜组织中,RhoA mRNA仅有微量表达,急性高眼压后1,3,7d,RhoA表达均显著高于正常组(P<0.05),7d组表达量最高。结论:大鼠急性高眼压损伤后,视网膜RhoA蛋白的分布及表达显著增加,其在介导抑制性信号阻断轴突再生的抑制过程中发挥着重要作用。     

睫状神经营养因子对大鼠急性高眼压眼视网膜神经节细胞的保护作用

背景 青光眼可以引起视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡,据报道睫状神经营养因子(CNTF)对外伤性视神经损伤有修复作用,其是否对青光眼视神经病变有保护作用尚少见报道. 目的 观察CNTF对大鼠急性高眼压眼RGCs的保护作用.方法 24只Wistar大鼠双眼采用眼前房平衡盐液加压灌注法建立大鼠急性高眼压模型,造模前2d左眼玻璃体内注入0.5μg CNTF 5μl,右眼以同样的方法注射磷酸钠溶液5μl,另取3只正常大鼠作为正常对照.造模后1、3、7、14 d过量麻醉法处死动物并摘除眼球,制备视网膜组织学切片后采用苏木精-伊红染色法进行形态学观察,光学显微镜下计数RGCs数目;采用免疫组织化学染色法观察RGCs层谷氨酸的表达情况.结果 正常对照组大鼠视网膜各层排列整齐,细胞边界清晰;模型对照组大鼠RGCs细胞膜、细胞核均发现异常改变,有细胞空泡样变;CNTF治疗组大鼠造模后变性的RGCs数量少.与模型对照组比较,造模后3、7、14 d CNTF治疗组RGCs数目明显增加,差异均有统计学意义(均P=0.000).免疫组织化学染色表明,造模后3～7d,CNTF治疗组RGCs层谷氨酸阳性细胞数分别为(5.50±1.04)个／3个高倍视野和(6.00±1.41) 个/3个高倍视野,明显低于模型对照组的(9.00±2.91)个／3个高倍视野和(10.83±1.94)个／3个高倍视野,差异均有统计学意义(均P=0.000),而造模后1d和14 d两组间谷氨酸阳性细胞数的差异均无统计学意义(P=0.578、0.180).结论 CNTF能够下调急性高眼压眼谷氨酸在RGCs中的表达,从而对RGCs提供保护作用.     

活血化瘀方剂对急性高眼压大鼠视网膜损伤的保护作用

目的观察活血化瘀方剂对急性高眼压大鼠视网膜损伤后的保护作用及对脑源性神经营养因子（BDNF）表达变化的影响。方法 100只清洁级Wistar大鼠随机分为正常对照组10只、穿刺组10只、模型组40只及模型＋中药组40只。采用前房灌注生理盐水加压法升高眼压至66mmHg,制作急性高眼压模型。模型组分别于造模后1、3、7、14d处死动物,模型＋中药组在造模后即刻给予2mL活血化瘀方剂灌胃,每日2次,并分别在给药后1、3、7、14d处死动物。苏木精-伊红染色光镜下观察各组视网膜的形态学改变;荧光免疫组织化学法测定BDNF蛋白在视网膜组织中表达量的变化;实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time PCR）法检测BDNF mRNA在视网膜组织中的表达。结果光镜下可见模型组造模后1d视网膜全层高度水肿,7~14d视网膜神经节细胞（RGCs）数目减少,视网膜萎缩变薄,模型＋中药组视网膜组织的病理损害程度较相应时间点模型组轻。荧光免疫组织化学染色可见急性高眼压后BDNF蛋白在视网膜组织中的表达在1d时达高峰,之后逐渐下降,其在模型＋中药组中的表达均高于相应时间点模型组（P〈0.05）。Real-time PCR半定量结果显示,高眼压后BDNF mRNA的表达变化趋势与荧光免疫组织化学染色结果一致,BDNF mRNA在模型＋中药组中的表达均高于相应时间点模型组（P〈0.05）。结论活血化瘀方剂对急性高眼压造成的视网膜损伤有保护作用,这种保护作用可能与其促进视网膜内源性BDNF的表达有关。     

葡萄糖调节蛋白在急性高眼压大鼠视网膜中的表达及其意义

背景 青光眼导致的视网膜神经节细胞(RGCs)进行性死亡是导致患者视功能损害的主要病理基础,研究表明内质网应激(ERS)参与此过程,葡萄糖调节蛋白78( GRP78)是内质网中的特异性标志物,检测GRP78在高眼压诱导视网膜中的表达对青光眼患者视神经功能保护机制的研究具有重要意义. 目的 检测GRP78在大鼠急性高眼压后不同时期视网膜中的表达情况,探讨ERS在急性青光眼损伤中的作用.方法 56只Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、前房穿刺组、急性高眼压12h组及急性高眼压1、3、7、14 d组,每组8只眼.急性高眼压模型的制作采用前房穿刺灌注生理盐水法,眼压提高至66 mmHg.分别于造模后12h及1、3、7、14 d用过量麻醉法处死大鼠.苏木精-伊红染色法观察各组大鼠视网膜的病理形态学改变;免疫组织化学法检测视网膜中的GRP78蛋白表达的变化;实时定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法检测视网膜中GRP78 mRNA的表达变化. 结果 正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐,急性高眼压后12h视网膜水肿增厚、细胞核肿胀,1d时视网膜形态学异常改变达到高峰,3d后水肿减轻,视网膜变薄.免疫组织化学染色显示正常对照组、前房穿刺组大鼠RGCs层和内核层GRP78蛋白呈弱阳性表达,A值分别为0.195±0.006、0.196±0.005,急性高眼压12h组大鼠GRP78在视网膜的表达明显增强,A值为0.293±0.011,造模后1d时GRP78表达强度达到高峰,A值为0.499±0.039,造模后3d时GRP78表达明显降低,A值为0.268±0.017,与正常对照组大鼠比较差异均有统计学意义(t=0.098、0.304、0.073,P＜0.05),但造模后7d和14 d时GRP78在大鼠视网膜RGCs层和内核层中的表达量接近正常,与正常对照组比较差异均无统计学意义( t=0.002、0.001,P＞0.05).实时定量RT-PCR检测表明,GRP78 mRNA在正常对照组大鼠视网膜的相对表达量( 2-△△CT)为1.011±0.013,眼压升高12 h快速上调,为1.536±0.145,1 d时达高峰,为2.141±0.171,3d时迅速降低,为1.420±0.212,与正常对照组比较差异均有统计学意义(t=0.525、1.130、0.409,P＜0.05),而造模后7d及14 d GRP78 mRNA在大鼠视网膜的表达量明显下降,与正常对照组比较差异均无统计学意义(t=0.020.0.004,P＞0.05).结论 GRP78参与大鼠急性高眼压后视网膜损伤的发生机制,提示通过对ERS过程进行干预可能达到保护急性高眼压眼视神经功能的目的.     

视神经损伤后视网膜CNTF及CNTFRα免疫组织化学检测

目的研究视神经损伤后睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）及其受体（ciliary neurotrophic factor recepterα，CNTFRα）在大鼠视网膜中的定位表达变化、方法采用钳夹法制作大鼠视神经损伤模型。分别于伤后1d、3d、7d、14d、28d取眼球，以正常大鼠视网膜为对照，运用免疫组织化学方法检测视神经损伤后CNTF和CNTFRα的表达变化,结果在正常对照组中，由视锥视杆细胞外节组成的视网膜视锥视杆细胞层均有大量的CNTF及CNTFRα存在，在其它各层也存在散在颗粒状分布的CNTF及CNTFRα，视神经损伤后，CNTF及CNTFRα在视网膜各层显著增加，并呈弥漫性分布，在损伤后3d、7d、14d与正常对照组比较相差非常显著（P〈0．01）。损伤后7d．CNTF及CNTFRα在视网膜各层表达达高峰，在损伤后28d2者的表达均显著高于正常对照组（CNTF：P=0．02〈0．05；CNTFR：P=0．015〈0．05）。结论视神经不全损伤导致了视网膜CNTF和CNTFRα表达量的增加和分布的改变，可能是视网膜神经元损伤后自我保护的一种反应。     

活血化瘀汤对急性高眼压模型大鼠视网膜谷氨酸转运体表达的影响

背景高眼压及缺血缺氧可使眼内谷氨酸的浓度增加,对视网膜神经节细胞（RGCs）造成兴奋性损伤,诱导其凋亡。国内外已进行了大量的谷氨酸兴奋性损伤的防护研究,但目前尚未见从细胞和分子水平对中药复方进行相关研究的报道。目的探讨活血化瘀汤方剂对急性高眼压模型大鼠视网膜谷氨酸转运体L-谷氨酸／L-天门冬氨酸转运体（GLAST）表达的影响。方法健康Wistar大鼠45只,随机分为正常对照组（5只）、单纯加压组（20只）、活血化瘀汤治疗组（20只）,后2组随机取一侧眼制作急性高眼压模型,活血化瘀汤治疗组于造模后即刻给予活血化瘀汤灌胃治疗,分别于给药后1、3、7、14d各时间点随机处死5只大鼠,单纯加压组分别在相同时间点随机处死5只大鼠,并获取其视网膜组织。用实时定量聚合酶链反应（real—time PCR）法检测3组大鼠视网膜中GLAST的表达变化,并对不同时间点视网膜组织行透射电镜及光学显微镜观察。结果急性高眼压损伤后3d,光学显微镜下可见视网膜变薄,14d时视网膜变得更薄,内层较显著,RGCs数量减少。透射电镜下,急性高眼压损伤后1d可见RGCs细胞器变性、肿胀,14d时出现部分细胞凋亡。Real—time PCR结果显示,单纯加压组及活血化瘀汤治疗组视网膜中GLAST mRNA的表达量在造模后1d快速上调,与正常对照组大鼠比较差异有统计学意义（P〈0．05）;3d时单纯加压组大鼠视网膜中GLAST mRNA表达量下降,与活血化瘀汤治疗组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;7d及1dd时单纯加压组与活血化瘀汤治疗组大鼠视网膜中GLAST mRNA的表达量均恢复至正常水平,2组间差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论活血化瘀汤方剂有可能通过增强GLAST的表达减轻急性高眼压对大鼠视网膜的损伤。     

原花青素对大鼠急性高眼压后视网膜作用的实验研究

探讨原花青素(PC)对大鼠急性高眼压后视网膜的作用及其机制。方法 将Spraque-Dawley(SD)大鼠随机分成正常组、模型组及PC高、低剂量组。PC高、低剂量组用原花青素蒸馏水悬浊液分别按100 mg/（kg·d）和300 mg/（kg·d）灌胃给药5 d,正常对照组和模型组则同步灌注蒸馏水,5d后模型组和PC各剂量组分别建立急性高眼压模型,48 h后取出建立高眼压模型的眼球。电子显微镜观察各组视网膜形态结构,紫外分光光度计比色法检测视网膜组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛 （MDA）、一氧化氮（NO）、谷氨酸（Glu）和钙离子（Ca2+）水平。结果 电子显微镜图片显示PC可减轻视网膜组织水肿,减少视网膜神经节细胞凋亡。PC可提高视网膜组织中SOD活性,降低MDA、NO、Glu和Ca2+水平。结论 PC对急性高眼压导致的视网膜损伤有保护作用,其主要机制可能与抗自由基氧化,拮抗钙离子超载,降低NO及Glu对视网膜的毒性作用有关。     

腺病毒介导睫状神经营养因子在大鼠视网膜中的表达定位

目的观察携带睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)基因的腺病毒(adenovirus,Ad)载体在正常大鼠视网膜中的表达定位。方法正常成年大鼠40只,随机分为处理组(PBS组、Ad-LacZ组、Ad-CNTF组)及正常对照组,向处理组大鼠眼内分别注射相应溶液,各处理组均分为注射后7d、14d、28d共3个时相点。在相应时相点取大鼠眼球,行冰冻切片,进行免疫组织化学染色。结果Ad-CNTF组各时相点视网膜与其他对照组相比,CNTF阳性染色明显增强,分布更广泛,并且可一直持续到注射后28d。结论Ad-CNTF在正常大鼠眼内注射后,CNTF在视网膜的表达明显增加,且表达时限可达28d。     

睫状神经营养因子及其受体在正常及变性视网膜中表达水平与分布的变化

目的 观察正常Sprague-Dawley（SD）和遗传性视网膜变性Royal College of Surgeons (RCS)大鼠视网膜发育过程中睫状神经营养因子(CNTF)及其受体(CNTFR)的表达水平与分布特点。 方法 新生至成年(12个月龄) SD和RCS大鼠视网膜石蜡切片，免疫组织化学染色显示睫状神经营养因子及其受体表达水平和分布变化。 结果 出生后0～7 d,SD大鼠神经视网膜全层染色呈阳性，随着周龄增加，节细胞染色明显增强，而其他细胞染色减弱，至28 d时节细胞染色达高峰，并持续至老年；RCS大鼠视网膜CNTF免疫组织化学染色结果与SD大鼠基本相同。出生后0～3 d, SD大鼠神经视网膜全层CNTFR的表达呈弱阳性，节细胞染色稍深，在将来要发育成外节处可见断续阳性染色；随着周龄增加，光感受器外节处阳性染色逐渐增强，14～28 d染色达到高峰；56 d时外节染色减弱，而节细胞染色却明显增强，直至老年。3～14 d RCS大鼠视网膜CNTFR染色基本与同龄SD大鼠一致，但21 d起外节染色明显减弱，28 d时外节染色基本呈阴性，但节细胞仍呈强阳性，一直持续到老年。 结论 CNTF的表达在正常和变性大鼠间无明显差异；CNTFR主要在节细胞和光感受器外节处高水平表达，正常和变性RCS大鼠间存在显著差异，为利用CNTF治疗视网膜变性提供了实验证据。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 120-123)     

Development of normal and injury-induced gene expression of aFGF, bFGF, CNTF, BDNF, GFAP and IGF-I in the rat retina

Focal mechanical injury to the retina substantially increases basic fibroblast growth factor (bFGF) and ciliary neurotrophic factor (CNTF) mRNA expression, accompanied by a transient increase in FGFR-1 mRNA, and this response is thought to protect photoreceptors near the injury site from inherited and light-induced retinal degenerations. We have now examined retinal gene expression of the principal survival factors involved in the response to injury in normal rats as a function of postnatal age both in normal and injured retinas. Sprague-Dawley rats were injured in one eye by needle incision through the retina at postnatal day (P) 10, 22, 35, 60, 90, 120 and 180. The other eye was uninjured and served as the control. Retinas were taken 1 day post-injury. Northern blot analysis was performed to determine the mRNA expression of the following factors and receptors: bFGF and acidic fibroblast growth factors (aFGF) and FGF receptor-1 (FGFR-1); CNTF and CNTF receptor alpha (CNTFR-alpha); brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its receptor trk B; and insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-I receptor (IGF-IR); glial fibrillary acidic protein (GFAP) and opsin. In the uninjured control eyes, mRNA expression of most of the factors increased with postnatal age, with little expression at P10 and maximal expression levels reached at P22 (opsin), P35 (aFGF), P60 (BDNF) or P90 (bFGF, FGFR-1, CNTF and GFAP). In contrast, IGF-1 mRNA rapidly decreased from a high level of expression at P10 to about 55% of that level by P22, reaching a stable 45-50% of the P10 level at P35 and thereafter. The response to injury of bFGF, FGFR-1, CNTF and GFAP mRNAs increased with postnatal age. Unexpectedly, only minimal increases in bFGF, FGFR-1, CNTF and GFAP over those seen in the control eyes were observed before P35. Thereafter, the increase of bFGF mRNA after injury reached a maximum of three-fold at P60, maintained this level to P120, and slightly decreased to 2.5-fold by P180. Expression of FGFR-1 mRNA showed a maximum increase of 2.6-fold at P90. Expression of CNTF and GFAP mRNAs followed a time course similar to that of bFGF. Mechanical injury did not alter the mRNA levels of aFGF, BDNF, IGF-I, and receptors, CNTFR-alpha, trk B and IGF-IR. These data show that the response to injury is minimal at early postnatal ages but increases with age and peaks at P60-90 for most potential survival factors.     

补肾益精方对外周血干细胞在RCS大鼠视网膜上的募集及睫状神经营养因子表达的影响

目的：观察补肾益精方对外周血骨髓间充质干细胞在视网膜变性模型（RCS）大鼠视网膜募集及睫状神经营养因子（CNTF）分泌的影响，探讨补肾益精方治疗视网膜退行性病变的作用机制。方法：实验研究。采用尾静脉注射方式将1×107个GFP标记的骨髓间充质干细胞（GFP-MSCs）注射至3周龄RCS大鼠外周血，然后按随机数字表法分为蒸馏水组及补肾益精方（BSYJ）组，每组39只。注射后第1天开始分别采用蒸馏水及补肾益精方药液灌胃，正常SD大鼠作为对照组常规饲养。给药7 d、14 d及28 d时分别采用视网膜铺片、免疫荧光显微镜观察GFP-MSCs在视网膜的募集情况；实时荧光定量PCR及免疫荧光双染技术检测视网膜表达CNTF的情况；TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况；采用单因素方差进行数据分析。结果：给药7 d、14 d和28 d时，蒸馏水组GFP-MSCs的数目少于BSYJ组，其中给药28 d时，2 组差异有统计学意义（t=2.71，P=0.001）。给药7 d、14 d和28 d时，BSYJ组CNTF表达较蒸馏水组均明显增加，3 组差异有统计学意义（F=5.763，P=0.003；F=3.165，P=0.042；F=4.839，P=0.004）。给药7 d和28 d时，BSYJ组视网膜细胞凋亡率明显少于蒸馏水组，3组差异有统计学意义（F=0.002，P=0.001；F=0.307，P=0.004）。结论：补肾益精方能够促进外周血干细胞在视网膜上的募集以及促进CNTF的表达，这可能是补肾益精方延缓RCS大鼠视网膜细胞凋亡和病变进程的作用机制之一。     

实验性视网膜缺血-再灌注损伤中坏死性凋亡相关因子的表达变化

目的　建立视网膜缺血-再灌注损伤（ｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ,ＲＩＲＩ）模型,观察坏死性凋亡是否参与其病理过程。方法　野生型Ｃ５７小鼠随机分为对照组及实验组。对照组不做任何处理,实验组采用前房灌注法建立ＲＩＲＩ模型,并于ＲＩＲＩ后１ｄ、２ｄ、４ｄ、７ｄ分别收集视网膜或眼球,行荧光定量ＰＣＲ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、免疫荧光染色检测受体相互作用蛋白（ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ,ＲＩＰ）３及ＲＩＰ１、白细胞介素-１β、白细胞介素-６、肿瘤坏死因子-α、Ｃａｓｐａｓｅ８的表达变化。结果　荧光定量ＰＣＲ检测ＲＩＰ３、ＲＩＰ１、白细胞介素-１β、白细胞介素-６、肿瘤坏死因子-α、Ｃａｓｐａｓｅ８的ｍＲＮＡ表达,与对照组比较,实验组在不同时间点均有显著升高,差异均有统计学意义（均为Ｐ＜０．００１）。ＲＩＰ３及ＲＩＰ１表达以早期升高为主,后期逐渐下降。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测发现ＲＩＰ３在ＲＩＲＩ后１ｄ及２ｄ显著升高,随后呈下降趋势。组织切片免疫荧光染色也发现ＲＩＰ３在ＲＩＲＩ后１ｄ及２ｄ显著升高,随后呈下降趋势。结论　实验性ＲＩＲＩ模型中,坏死性凋亡参与了其病理过程。坏死性凋亡特异性蛋白ＲＩＰ３表达以早期升高为主,后期逐渐下降。