结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .     

结核菌H37Ra免疫小鼠后PPD刺激淋巴细胞增殖转化的探讨

目的:探讨小鼠接种H37Ra后,PPD刺激鼠淋巴细胞的增殖转化情况.方法:用H37Ra皮内、腹腔免疫小鼠后30、60天,检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的转化率.结果:小鼠接种H37Ra后,30天淋转率分别为21.98%(腹腔)和24.85%(皮内);60天淋转率分别为25.50%(腹腔)和25.02%(皮内),明显高于未免疫组(P＜0.01);与BCG皮内免疫组比较,无显著性差异(P＞0.05);H37Ra腹腔和皮内不同途径接种,淋巴细胞转化率无明显差异.结论:H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生抗结核的免疫应答.     

结核菌H37Ra在小鼠体内诱导的抗结核细胞免疫应答的研究

目的:研究结核菌H37Ra免疫小鼠后产生的特异性细胞免疫应答及其对结核分枝杆菌(Mycobacteriun tubetculosisMTB)毒株感染的保护力.方法:Balb/c小鼠随机分为H37Ra组、BCG组和生理盐水(NS)组,皮内免疫8周后处死小鼠,流式细胞分析仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的变化;取小鼠脾淋巴细胞体外培养并用PPD刺激,MTT法检测脾淋巴细胞的刺激指数(SI);ELISA法检测培养上清液中IFN-?;免疫后第8周,用MTB毒株H37Rv经小鼠腹腔注射,4周后处死小鼠,测定小鼠肺脏荷菌量,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:H37Ra免疫小鼠脾脏CD3 T细胞、CD4 T细胞的百分率分别为(41.63±1.68)%、(27.08±0.58)%,显著高于NS对照组(38.34±0.74)%、(24.37±1.60)%(P<0.05). H37Ra免疫组脾脏CD3 T细胞、CD4 T细胞及CD8 T细胞的百分率均不同程度地高于BCG免疫组,但差异无统计学意义.脾淋巴细胞SI和IFN-?水平检测均发现H37Ra免疫组显著高于NS对照组(P<0.05),略高于BCG免疫组.感染4周后H37Ra组小鼠肺脏荷菌量与NS对照组比较下降0.954log10CFU,差异有显著性(P<0.05),与BCG组之间差异均无显著性(P>0.05).结论:H37Ba免疫小鼠后可以诱导产生特异性抗结核的细胞免疫应答,能够抵抗毒株H37Rv的攻击,且免疫效果与BCG相近.     

结核菌H37Ra免疫小鼠后巨噬细胞TNF-α表达的初步探讨

目的:探讨小鼠接种结核菌H37Ra株后,巨噬细胞表达TNF-α的活性情况.方法:H37Ra皮内、腹腔途径免疫小鼠后第30、60天,采用生物学活性方法检测小鼠腹腔巨噬细胞表达的TNF-α活性.结果:小鼠接种H37Ra后,30天时TNF-α活性分别为22.06U/ml(腹腔)和22.63U/ml(皮内);60天时TNF-α的活性分别为36.76U/ml(腹腔)和33.78U/ml(皮内),明显高于未免疫组(P＜0.01);与BCG皮内免疫组比较,30天时无显著性差异(P＞0.05),60天时有明显差异(P＜0.05).结论:H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生TNF-α.     

结核分枝杆菌H37Ra免疫小鼠后细菌在体内定植的研究

目的:了解H37Ra(人型结核分枝杆菌标准无毒株)免疫小鼠后在体内生长情况.方法:将H37Ra和BCG分别皮内接种C57BL/6小鼠,免疫后15天、30天及60天,取稀释小鼠脾脏和肺脏匀浆接种罗氏培养基,培养18天后计菌落数(CFU).结果:免疫后15天、30天及60天,H37Ra在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU为1.95、1.57、2.54和1.37、1.08及0.94;BCG在小鼠脾脏、肺脏定植的平均Log10CFU则为1.72、1.39、1.06和1.16、0.96及0.50.免疫后15天及30天,脾脏及肺脏定植的H37Ra和BCG无显著性差异(P＞0.05);免疫后60天,脾脏及肺脏定植的H37Ra显著多于BCG(P＜0.05).H37Ra和BCG在脾脏定植的细菌数显著多于肺脏(P＜0.05).结论:H37Ra在C57BL/6小鼠体内至少可以存活2个月.     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠脾组织IL-35 mRNA表达及其意义

目的:探讨H37Ra菌株感染后小鼠脾脏IL-35 mRNA的表达情况,分析其在结核分枝杆菌(M.tb)感染中的作用与意义。方法:将清洁级C57B/L6小鼠分为对照组、感染4周组和感染8周组,每组10只。采用H37Ra菌株感染后,观察小鼠一般状况与肺组织病理,并检测肺部感染细菌数及脾组织IL-35的mRNA表达水平。结果:H37Ra菌株感染小鼠在不同时段其脾组织IL-35(EBI3亚基和P35亚基)的mRNA表达均高于对照组(P<0.01),感染8周组的脾组织IL-35的mRNA表达水平更高(P<0.01)。结论:结核分枝杆菌H37Ra菌株感染小鼠后脾组织IL-35 mRNA表达水平升高,IL-35表达可能与结核分枝杆菌感染密切相关。     

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核菌H37Ra免疫小鼠后机体抗结核细胞免疫功能的研究

目的探讨小鼠皮内接种H37Ra后,细菌在体内的定植及机体能否产生针对结核菌的免疫力. 方法用H37Ra皮内免疫小鼠后15、30、60 d,检测结核菌在小鼠体内脏器的定植;免疫后第30、60天,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后的增殖转化刺激指数、ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞受PPD刺激后IL-2、sIL-2R的表达量. 结果小鼠脾、肺脏中有结核菌定植,并至少存活60 d;脾淋巴细胞30、60 d的刺激指数分别为(2.81±0.63)、(2.16±0.52),与BCG皮内接种组无显著性差异,与未免疫组有显著性差异(P<0.05);脾淋巴细胞IL-2、sIL-2R表达量分别为(126.88±8.11)、(91.26±7.29)pg/ml和(138.58±7.67)、(127.09±5.47)pg/ml,与BCG皮内接种组、未免疫组比较均有显著性差异(P<0.05). 结论 H37Ra免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗结核免疫力,且免疫效果略优于BCG.     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的　为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法　根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果　PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论　成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 ,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。