细菌表面展示纳米级白蛋白的实验研究

目的 建立细菌表面展示纳米级白蛋白的体系.方法 将球形芽孢杆菌表面层蛋白编码基因sllB的3 ′端截短后与人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)编码基因融合,5′端与链霉抗生物素蛋白(Strep-tagI)的编码基因连接,置于大肠杆菌中表达.用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE...     

铜绿假单孢菌连续分离株耐药性与Ⅰ类整合酶基因的研究

目的了解铜绿假单孢菌临床连续分离株Ⅰ类整合酶基因(inⅠt1)存在情况和耐药性。方法采用聚合酶链反应方法检测97株铜绿假单孢菌inⅠt1。结果97株铜绿假单孢菌中有72株inⅠt1基因阳性(74.2%);其中多重耐药菌,耐药菌、敏感菌inⅠt1基因检出率分别84.7%(61/72)、8.9%(6/72)、6.4%(5/72)(P<0.01)。结论inⅠt1在铜绿假单孢菌中广泛分布,Ⅰ类整合子介导的耐药基因可能与铜绿假单孢菌多重耐药密切相关。     

D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰基转移酶基因在大肠杆菌中的克隆和共表达 Luo H等[Enzyme Microb Technol，2004，35（6-7）：514．518]

为了将头孢菌素C转化成-7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，克隆了来源于变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因和来源于假单孢菌的戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰基转移酶基因，并在重组大肠杆菌中表达。对DAAO重组菌BL21(DE3)/pET-DAAO而言，通过分批补料培养可获得250U／ml的高DAAO活性。信号肽序列缺失的GL-7-ACA酰基转移酶基因也成功地在重组大肠杆菌BL21(DE3)／pET-ACY中得到表达，     

重组芽孢杆菌脂肪酶拆分制备(R)-氟比洛芬

利用大肠杆菌M15表达芽孢杆菌的脂肪酶基因，重组蛋白经亲和色谱纯化，得到比活力为30.25u／mg的纯化酶。以纯化酶催化水解50mmol／L的氟比洛芬乙酯，在55℃、pH9．0的条件下，所得产物（R）-氟比洛芬ee值为99.6％。     

胃泌素释放肽前体融合蛋白的制备及其在肿瘤研究中的应用

目的克隆胃泌素释放肽前体(pro-GRP)基因、构建重组质粒pGEM-T-pro-GRP和表达载体PMS-31b-pro-GRP、在大肠杆菌中热诱导表达并制备融合蛋白。方法从BGC823胃癌细胞中提取总RNA,利用pro-GRP特异引物,扩增人pro-GRP分子的cDNA全长。将pro-GRP基因定向克隆于pGEM-T载体转化JM109,DNA测序鉴定基因序列。将pro-GRP基因定向克隆于原核高效表达载体PMS-31b,转化大肠杆菌POP2136经42℃热诱导表达MS2-pro-GRP融合蛋白。将融合蛋白分离纯化后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶鉴定。结果经聚合酶链反应(PCR)扩增成功获得210bp的pro-GRP基因,目的基因序列正确。SDS-PAGE显示热诱导后表达的融合蛋白分子量约为18000。结论成功克隆pro-GRP基因,并表达和纯化了PMS-31b-pro-GRP融合蛋白,为建立pro-GRP检测方法奠定了基础。     

应用代谢工程改进生物技术合成靛蓝的产量及应用

通过改变色氨酸途径生成高水平的吲哚以及加入来自假单孢菌的编码萘过氧化物酶基因 ,研究了用重组大肠杆菌以葡萄糖为原料生产靛蓝 (1)的发酵工艺。与色氨酸高产菌相比 ,第一株菌产生 1的量不足期望值的一半。在合成 1的细胞中观察到芳香族生物合成的第一个酶—— 3-脱氧 - d-阿拉伯庚糖酸 - 7-磷酸 (DAHP)合成酶 (是 aro Gfbr基因产物 )严重失活。随后的体外实验表明由于吲哚酚的自发化学转变成1而导致了 DAHP合成酶的失活。因此可通过 3种策略来增加 1的产量 :增加 aro Gfbr基因量 ,或者在体内扩增 tkt A(转酮酶基因 )及使两种丙酮酸…     

百多邦软膏的药理作用及临床应用

<正> 1.百多邦软膏的药理作用 百多邦又名莫匹罗星(M.R),是一种新型抗生素,由荧光假单孢菌产生,具有特殊的结构,其分子中的短脂肪酸链通过和酯链连接到大的单孢菌酸分子上,主要的抗菌方式是在金黄色葡萄球菌及大肠杆菌中抑制蛋白质的合成,其细菌细胞上的靶点为     

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化.方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI.在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定.结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrapKit成功纯化目的蛋白.ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性.结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础.     

抗动脉粥样硬化疫苗的制备及免疫学研究

为了增强胆固醇酯转移蛋白(CETP)羧基末端的26肽B细胞抗原表位的免疫原性,以大肠杆菌L-门冬酰胺酶II(AnsB)为载体,通过引入2个强的辅助T细胞表位.构建了融合基因AnsB-TTP-PADRE-CETPC,并在大肠杆菌BL-21(DE3)表达,经过硫酸铵沉淀、DEAE 52纤维素阴离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析,最终得到单一电泳条带纯度的目的蛋白.纯化的融合多肽疫苗免疫新西兰大白兔可诱导产生高水平持续存在的抗CETP抗体,从而抑制了CETP酶活力,显著抑制了兔主动脉斑粥样硬化斑的形成和发展.该融合蛋白有希望作为抗动脉粥样硬化疫苗进一步研究开发.     

GL—7ACA酰化酶的提取

假单孢菌79u-18菌株产生GL-7ACA的同时产生β-内酰胺酶。我们找到了一种简单有效的方法使β-内酰胺酶失活而不影响GL-7ACA酶活力。用冻融 -溶媒法提胞内酶GL-7ACA。酶回收率达60％以上,可用于工业化生产。     

人胰升血糖素样肽1突变体基因的克隆及在原核细胞的表达

目的 构建人胰升血糖素样肽1(hGLP-1)突变体基因的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达.方法 用生物合成方法获得hGLP-1突变体基因8Val-hGLP-1,将其克隆于载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/8Val-hGLP-1融合表达载体,转化大肠杆菌BL21,酶切电泳以及测序鉴定阳性克隆,用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法检测其重组蛋白诱导表达情况.结果 重组质粒pGEX-4T-1/8Val-hGLP-1经双酶切电泳鉴定与测序分析证实构建成功,SDS-PAGE与蛋白免疫印迹分析证实其成功诱导表达重组融合蛋白.结论 成功地克隆了hGLP-1突变体基因8Val-hGLP-1,并在大肠杆菌中进行表达,为下一步获得含突变体基因的重组hGLP-1蛋白及其生物学功能研究奠定良好基础.     

鸡贫血病毒vp3基因融合表达载体的构建及表达

为构建鸡贫血病毒vp3基因(肿瘤特异性凋亡基因)的原核融合表达载体，并在大肠杆菌中进行表达,采用常规分子克隆技术，将vp3基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-2中，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α。经异丙基—α—D—硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，用SDS—PAGE检测表达产物。经限制性内切酶酶切和PCR扩增，表明vp3基因成功地克隆副原核表达载体上，分子量为380bp；SDS-PAGE电泳显示，构建的表达载体表达出分子量(Mr)约为39600的融合蛋白，与预期的结果相符。结论：采用上述方法可成功地构建vp3蛋白的融合表达载体，并在大肠杆菌中获得有效表达，对于vp3蛋白的大量制备、深入研究其诱导肿瘤细胞的性质具有实际意义。     

Balb／C小鼠金属硫蛋白—1基因在大肠杆菌中的高效表达

将Balb/C小鼠金属硫蛋白－1基因克隆于质粒表达载体pET-21a上,克隆采用限制性内切酶BamH1与EcoR1酶切pET21a及金属硫蛋白－1基因PCR产物,连接成pET21a-MT重组质粒,并将其转化进入大肠杆菌表达受体菌BL21（DE3）中,经异丙基－β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）证实产生高效表达金属硫蛋白－1基因的金属硫蛋白融合蛋白。表达蛋白在胞内主要以不溶性包涵体存在。     

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

噬菌体展示技术及其在药物开发中的应用

噬菌体表面展示技术(Phage D isplay T echn iques,PDT)是二十世纪八十年代逐步建立并发展起来的一项新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体,它实现了基因型和表型的一对一转换,提供了高效率的筛选系统,噬菌体展示技术是真正第一个用于体外高通量筛选的技术方法。利用噬菌体表面展示技术可以构建抗体库、随机肽库、蛋白质突变体库和cDNA文库,从而广泛用于单克隆抗体的筛选、先导化合物的筛选、疫苗的研制,改造和提高蛋白类药物、酶和抗体的生物学和免疫学属性,尤其是在抗原表位分析、受体与配体结合位点确定等分子间识别机制的研究方面,具有广阔的应用前景。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni~(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。     

hCu,Zn-SOD-TAT PTD的融合表达及其跨膜转运性质的初步研究

HIV I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力 ,被称为TAT蛋白转导结构域 (proteintransductiondomain ,PTD)。从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu ,Zn SOD基因 ,插入pUC19测序 ;以测序质粒为模板 ,再用含TATPTD编码序列的 3’引物PCR扩增得hCu ,Zn SOD TATPTD融合基因 ,并插入 pUC19。将SOD基因和SOD TATPTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体 pJW 2 ,转化大肠杆菌DH5α。SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,热击诱导 4h后 ,分别在 19ku和 2 2ku处出现SOD和SOD TATPTD目标表达条带 ,表达蛋白以包含体形式存在。分别提取SOD和SOD TATPTD包含体 ,复性纯化后SOD和SOD PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性 ,其比活性分别为 12× 10 3 NU/mg和 9.9× 10 3 NU/mg。细胞试验结果表明 ,与SOD相比较 ,SOD TATPTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力。     

大肠杆菌的高密度培养

大肠杆菌是最广泛用于异源性蛋白合成的原核系统。最适表达系统一旦构建成功，通过增加生单位时间每个菌休的蛋白产量（单位生产率），或通过增加每单位时间的菌体浓度（菌体生产率）而使蛋白产量增加。已开发出在加料分批培养中培养重组与非重组大肠杆菌株达每升１００ｇ（菌体干重）量的各种主细胞密度培养（ＨＣＤＣ）技术。本文综述了大肠杆菌ＨＣＤＣ所遇到的问题，讨论了不同的解决办法。不好大肠杆菌ＨＣＤＣ的加料策略及使用     

C端融合RGD三肽的重组L-门冬酰胺酶基因克隆、表达和对血液系统的影响

利用加端PCR技术构建asnB-RGD工程菌，获得C末端带有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，ArgGly-Asp)三肽的门冬酰胺酶(AnsB-RGD)，以改进L-门冬酰胺酶的作用。以pUA18为模板，利用pUC18上游普适引物和根据L-门冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB)C末端下游序列设计的引物来扩增目标基因。将目标基因连于pMD18-T载体，转化宿主菌JM109，筛选出的阳性克隆通过HindⅢ、NcoⅠ双酶切下目标基因连到含T7启动子的高效表达载体pET28a上，再转化BL21宿主菌。高效表达的工程菌摇瓶发酵，渗透休克法提取AnsB-RGD融合蛋白，12％的SDS-PAGE检测酶蛋白并考察酶的活力、特异性及其对血液系统的影响。2％琼脂糖凝胶电泳、DNA测序鉴定构建的pET28a．ansB．RGD工程菌，奈氏法、SDS-PAGE及免疫学方法检测AnsB-RGD融合蛋白。DNA序列分析证明RGD三肽已经连接在L-门冬酰胺酶的C末端，带有RGD三肽的融合蛋白仍然能与抗L-门冬酰胺酶的抗体结合，初步发现AnsB-RGD融合蛋白有促进血液凝固作用，但酶活力下降。