磷酸肌酸钠对慢病毒介导Calumenin蛋白沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激信号通路的作用

目的:探讨磷酸肌酸钠对网腔钙结合蛋白(Calumenin)沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激信号通路作用。方法:培养乳鼠心肌细胞,构建稳定的慢病毒——Calumenin质粒,转染乳鼠培养心肌细胞,实验分为4组:对照组(正常细胞+3mg/L阿霉素)、模型组(慢病毒感染细胞+3mg/L阿霉素)、磷酸肌酸钠1组(正常细胞+阿霉素+磷酸肌酸钠)、磷酸肌酸钠2组(转染细胞+阿霉素+磷酸肌酸钠)。采用Western blotting技术检测各组心肌细胞Calumenin蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子PERK、PATF-4PERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达。结果:1与对照组比较,模型组及磷酸肌酸钠2组心肌细胞Calumenin蛋白表达明显减少(P0.01)。2与对照组相比,模型组内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子PPERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达明显增多(P0.01)。3与模型组相比较,磷酸肌酸钠1组及磷酸肌酸钠2组内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子P-PERK、eIF2ɑ、ATF-4、IRE1、CHOP表达减少(P0.01)。结论:阿霉素损伤可能诱发ERS,并通过ERS凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP/IRE1→CHOP引起心肌细胞凋亡;磷酸肌酸钠可抑制阿霉素损伤所诱导内质网应激介导的心肌细胞凋亡,这一作用机制可能是通过Calumenin蛋白抑制ERS及其凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF-4→CHOP/IRE1→CHOP实现的。     

内质网应激PERK途径在高糖诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化中的作用

目的：研究高糖刺激SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转分化中内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径的作用。方法原代培养VSMCs,分为正常对照组（5mmol/L D-葡萄糖）,甘露醇组（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇）,高糖组（30mmol/L D-葡萄糖）,高糖＋PERK-小干扰RNA（siRNA）转染组（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA转染）,高糖＋RNA干扰阴性对照组（30mmol/L D-葡萄糖＋乱序RNA转染）。分别作用48和72h。逆转录-聚合酶链反应及Western blot分别从信使RNA（mRNA）和蛋白质水平检测不同时间点内质网应激相关分子GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4的改变,以及成骨样细胞标志性分子核心转录因子（Cbfα-1）、骨钙素以及平滑肌细胞标志性分子α-SMA的改变情况。应用碱性磷酸酶（ALP）活性检测试剂盒检测ALP的活性。结果与正常对照组和甘露醇组比较,在mRNA水平,高糖组和高糖＋RNA干扰阴性对照组PERK和eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达水平均降低（P＜0.05）,在蛋白质水平,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表达升高（P＜0.05）,PERK-siRNA干预后其表达均降低（P＜0.05）。高糖刺激VSMCs后ALP活性升高（P＜0.05）,PERK-siRNA转染后其表达均降低（P＜0.05）。结论内质网应激PERK途径在高糖诱导VSMCs由收缩表型向成骨样细胞表型转化中发挥作用,抑制PERK途径可以部分阻止这一转化过程。     

miRNA378*对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞凋亡、网腔钙结合蛋白、内质网应激及信号通路因子的作用

目的:探讨上调miRNA378*表达对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞凋亡、网腔钙结合蛋白、内质网应激及信号通路因子的作用。方法:实验分4组:对照组(正常细胞)、CVB3感染组(正常细胞+CVB3)、miRNA378*过表达对照组(正常细胞+CVB3+转染miRNA378*空表达质粒)、miRNA378*过表达组(正常细胞+CVB3+转染miRNA378*过表达质粒)。原代培养乳鼠心肌细胞,采用免疫组织化学方法检测培养乳鼠心室肌细胞α-SMA蛋白,慢病毒质粒转染心室肌细胞,除对照组外,其他各组心肌细胞感染CVB3,采用TUNEL技术检测各组心肌细胞凋亡率;用Western blotting技术检测各组心肌细胞网腔钙结合蛋白、内质网应激伴侣蛋白GRP78及内质网应激信号通路因子PERK、P-PERK、eIF2α、ATF4、CHOP表达。结果:与CVB3感染组比较,miRNA378*过表达组心肌细胞凋亡率明显减少,网腔钙结合蛋白表达增加,而GRP78、P-PERK、eIF2α、ATF4、CHOP表达均减少(均P0.01),PERK表达差异无统计学意义。结论:上调CVB3感染心肌细胞miRNA378*表达可引起心肌细胞凋亡减少,网腔钙结合蛋白表达增多,进而缓解内质网应激,并抑制内质网应激凋亡信号通路因子表达。     

消癌解毒方通过内质网应激诱导肝癌HepG2细胞凋亡的研究

[目的]探讨内质网应激在消癌解毒方在人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用。[方法]CCK-8法检测不同浓度的消癌解毒方处理HepG2细胞12、24、48 h后细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测细胞消癌解毒方处理HepG2细胞24 h凋亡情况;应用qRT-PCR检测内质网应激上游分子标记GRP78、PERK、ATF-6、IRE-1的mRNA水平;采用Western blot方法分析消癌解毒方对PERK、ATF4、CHOP和TRB3蛋白的表达情况;并用CCK-8法检测内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)对HepG2细胞凋亡率的影响。[结果]消癌解毒方抑制HepG2细胞的增殖,并且这种效应呈现时间和浓度依赖;ATF-6和IRE-1 mRNA水平无明显变化,GRP78和PERK mRNA水平较阴性对照组均显著增加;消癌解毒方可上调内质网应激通路的标志蛋白质PERK、ATF4、CHOP水平,增加下游TRB3蛋白的表达。4-PBA与消癌解毒方联合作用组的细胞凋亡率显著减少。[结论]消癌解毒方通过内质网应激诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,其可能是通过PERK通路上调内质网应激相关凋亡蛋白CHOP的表达。     

抑制内质网应激关键信号通路蛋白eIF2α去磷酸化与肝细胞增殖及c-Met表达的关系

目的 探讨抑制内质网应激（ERS）关键信号通路蛋白真核细胞起始因子2α(eIF2α)去磷酸化与肝细胞增殖及促肝细胞生长因子受体（c-Met）表达的关系。方法 将人肝细胞株L02分为对照组和胡萝卜素（TG）组，TG组加入含内质网钙平衡抑制剂毒胡萝卜素（TG）的RPMI1640培养基，诱导构建细胞ERS模型；对照组仅加入RPMI1640培养基，培养48 h。采用CCK-8检测细胞活力，Western blotting法检测细胞ESR相关蛋白p-eIF2α、ERAD通路相关蛋白HRD1、XBP1以及c-Met蛋白表达。另取L02细胞，分为TG组和Salubrinal+TG组，Salubrinal+TG组给予eIF2α去磷酸化抑制剂Salubrinal预处理2 h，然后加入1μmol/L TG培养48 h;TG组加入1μmol/L TG培养48 h。采用CCK-8检测细胞活力，Western blotting法检测细胞eIF2α、p-eIF2α、HRD1、XBP1、c-Met蛋白表达。结果 与对照组相比，TG组p-eIF2α、HRD1表达水平升高，TG组ERS相关蛋白p-eIF2α表达上调，E...     

过表达NR2E1对棕榈酸诱导的NIT1细胞凋亡及内质网应激的影响

目的研究孤儿核受体NR2E1对棕榈酸(PA)诱导的胰岛β细胞凋亡及内质网应激的影响。方法建立过表达NR2E1小鼠胰岛细胞系NIT1细胞株,予500μmol/L PA处理24 h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)mRNA表达变化,Western blot检测磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIF2α)的水平。结果过表达NR2E1能减少PA诱导的NIT1细胞凋亡率[(27.5±0.4)%vs(11.9±0.4)%]和CHOP mRNA表达[(10.54±1.98)vs(3.03±0.49)],增加GRP78 mRNA表达[(3.28±0.20)vs(5.28±0.49)]和eIF2α磷酸化水平[(1.26±0.13)vs(1.67±0.06)](P0.05)。结论过表达NR2E1能减轻PA诱导的胰岛β细胞凋亡,其机制可能与调节内质网应激有关。     

血管生成素2与内质网应激相关基因在肥胖患者内脏脂肪组织中表达及相关关系的研究

目的探讨肥胖患者内脏脂肪组织中血管生成素2(Ang-2)基因与内质网应激相关基因表达水平及其相关关系。方法选取行胆囊切除术患者204例,以BMI 25kg/m2为切点,分为肥胖(Ob)组及正常体重(Nob)组。ELISA测定Ang-2浓度,稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。RT-PCR检测脂肪组织中内质网应激相关基因、Ang-2基因和MCP-1mRNA的表达水平。Western blot检测脂肪组织中Ang-2、内质网应激相关基因和MCP-1基因的蛋白表达。结果 (1)Ob组网膜脂肪组织中,内质网应激蛋白相关基因重链结合蛋白(Bip)、肌醇需求蛋白激酶Ⅰ(IREⅠ)、类PKR内质网应激酶(PERK)、氧调节蛋白150(ORP150)、转录激活因子6(ATF6)、X盒结合蛋白1(XBP1)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)及Ang-2的mRNA表达量均高于Nob组(P0.01);Ob组磷酸化真核翻译起始因子(elF2α)蛋白高于Nob组,但差异无统计学意义[(1.05±0.40)vs(1.10±0.90),P0.05];(2)PERK和ORP150的表达量与BMI相关;(3)脂肪组织中Ang-2、MCP-1分别与Bip、ORP150、XBP1及IREⅠ表达量有关(P均0.05)。多因素回归分析显示,Ang-2与内质网应激基因Bip、IREⅠ、PERK、ATF6、ORP150及MCP-1相关;(4)Ang-2和MCP-1在肥胖患者血中及脂肪组织中表达差异无统计学意义(P0.05)。结论肥胖患者内脏脂肪组织中Ang-2水平升高,内质网应激被激活;Ang-2基因与内质网应激相关基因及MCP-1的表达有关。     

PERK-eIF2α-ATF4通路在波动性高糖损伤胰岛β细胞分泌功能中的作用

目的 旨在探讨内质网类似激酶(PERK)-真核细胞翻译启始子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)通路介导的内质网应激在波动性高糖影响胰岛β细胞分泌功能中的作用.方法 评价波动性高糖对β细胞分泌功能的影响,并采用实时定量PCR及Western印迹等方法检测内质网应激因子的表达变化.结果 经过24和48 h孵育后,波动性高糖组(FH组)细胞同正常糖对照组(NG组)相比胰岛素分泌能力明显降低,而持续性高糖组(SH)和NG组相比无显著差别.经过72 h孵育后,FH组和SH组细胞分泌胰岛素能力均明显降低,FH组降低得更显著.细胞孵育72 h后,FH较SH组和NG组细胞内磷酸化的RNA激活蛋白激酶的PERK、eIF2α及ATF4水平均明显升高.结论 波动性高糖通过PERK-eIF2α-ATF4通路诱导内质网应激而损伤胰岛β细胞分泌功能,对胰岛β细胞而言较持续性高糖更具危险性,因此积极地预防和治疗波动性高血糖将成为糖尿病新的临床治疗方向.     

红景天苷通过抑制内质网应激减少高同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

目的研究红景天苷对高同型半胱氨酸诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)预处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC),再使用1 mmol/L Hcy与不同浓度红景天苷共同作用HUVEC。24 h后,MTT法检测细胞存活率。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)和C/EBP同源蛋白(CHOP)的基因表达水平,Western blot检测Bip、CHOP蛋白表达水平、PKR内质网激酶(PERK)及内质网核信号转导蛋白1α(IRE1α)磷酸化水平。结果与正常对照组比较,Hcy组细胞存活率降低,Bip和CHOP的基因和蛋白水平升高,PERK和IRE1α的磷酸化水平升高(P0.05)。与Hcy组比较,高浓度红景天苷(300μmol/L)与Hcy共同作用后细胞存活率升高,Bip和CHOP的基因和蛋白表达水平下降,PERK和IRE1α的磷酸化水平下降(P0.05)。结论红景天苷对高同型半胱氨酸诱导的HUVEC损伤具有保护作用,其机制可能与抑制内质网应激信号通路的活化有关。     

BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化

目的观察慢病毒介导的BMP-7高表达是否能抑制大鼠HSC-T6细胞发生上皮-间叶转化（epithelial to mesenchymal tran-sition,EMT）,并能拮抗TGF-β1的促EMT作用。方法构建大鼠BMP-7慢病毒表达载体,体外感染HSC-T6细胞株,将成功感染BMP-7重组慢病毒的细胞给予TGF-β1（5 ng/mL）或溶酶体处理。Real-time PCR检测α-SMA、S100A4、E-cadherin mRNA转录水平。Western blotting检测α-SMA、S100A4、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。结果 BMP-7慢病毒感染HSC-T6后,无论TGF-β1存在与否,real-time PCR检测到α-SMA、S100A4 mRNA转录下调,E-cadherin转录上调。Western blotting显示α-SMA、S100A4及Ⅰ型胶原蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调。实验组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义。结论 BMP-7能有效拮抗TGF-β1对HSC-T6的促EMT作用,可能成为肝纤维化治疗的新途径。     

针刺对PERK-CHOP通路及胰腺组织中内质网应激的影响

目的 观察针刺对2型糖尿病大鼠RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶-增强子结合蛋白同源蛋白(PERK-CHOP)通路、内质网应激的干预作用。方法 选用SPF级雄性SD大鼠80只,除对照组外,其余采用高脂高糖饲料加低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备STZ-DM大鼠模型。随机分为4组,分别为对照组、模型组、针刺治疗组和药物组。针刺治疗组取后三里、内庭、胰俞进行治疗;药物组：100 mg/kg盐酸二甲双胍灌胃,疗程与针刺治疗组平行;模型组和对照组不做其他任何处理。疗程结束后采用RT-PCR和Western印迹检测各组大鼠胰腺组织的CHOP、PERK的蛋白表达、mRNA的转录水平及电镜下内质网的形态学改变。结果 与模型组比较,针刺治疗组和药物组CHOP、PERK蛋白表达显著下降(P<0.05);电镜下观察模型组内质网极度扩张,而针刺治疗组内质网扩张得到改善。结论 针刺可能通过抑制PERK-CHOP通路来改善胰腺组织中的内质网应激,从而对治疗糖尿病产生一定的作用。     

小檗碱抑制内质网应激炎症通路对2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤的探讨

目的观察小檗碱(BBR)对2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤半影区内质网应激相关炎症通路的影响。方法72只健康雄性Sprague-Dawley大鼠,采用高脂饮食和链尿佐菌素注射建立2型糖尿病大鼠模型,数字抽签随机将糖尿病大鼠分为假手术组(Sham组)、糖尿病大鼠+BBR治疗组(BBR组)、糖尿病大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型组(MCAO组)、糖尿病大鼠MCAO+BBR治疗组(MCAO+BBR组),纳入研究每组6只。治疗组在术前48 h、24 h和术后6 h经胃灌注给予相应剂量药物。采用线拴法制备大鼠MCAO模型,进行神经缺损评分,酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的表达;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测内质网应激标志蛋白葡萄糖调控蛋白78(GRP78)的mRNA表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测内质网应激相关炎症通路蛋白GRP78、胰腺内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、核因子(NF)-κB p65表达情况。结果在脑缺血半影区,缺血2 h再灌注24 h后,MCAO组大鼠神经功能缺损评分(2.83±0.41)分,高于MCAO+BBR组大鼠(1.67±0.52)分(P<0.05),促炎因子TNF-α和IL-1β和内质网应激相关炎症通路蛋白GRP78、PERK和NF-κB p65的表达水平亦增高(P<0.05)。BBR治疗亦可降低脑缺血再灌注半影区促炎因子(TNF-α和IL-1β)和内质网应激相关炎症通路蛋白(GRP78、PERK和NF-κB p65)的表达水平。结论BBR可通过抑制内质网应激相关炎症通路降低2型糖尿病大鼠局部脑缺血再灌注损伤的炎症反应,发挥神经保护作用。     

7-酮基胆固醇通过激活内质网应激通路诱导胰岛β细胞凋亡的研究

目的探讨7-酮基胆固醇(7-KC)对胰岛β细胞凋亡的影响及其可能分子机制。方法用0、0.25、2.5和25 μmol/L浓度的7-KC孵育INS-1细胞24 h, 应用Western blotting法筛选出引起INS-1细胞凋亡的浓度。再将INS-1细胞分为对照组、25 μmol/L 7-KC组、25 μmol/L 7-KC+1 mmol/L 4-苯基丁酸(4-PBA)组以及1 mmol/L 4-PBA组。应用Western blotting、流式细胞仪、免疫荧光、电镜和免疫共沉淀技术, 检测细胞内质网应激标志蛋白[肌醇需求酶1α(IRE-1α)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、转录激活因子4(ATF4)、磷酸化α亚基的真核起始因子2(p-eIF-2α)、α亚基的真核起始因子2(eIF-2α)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化IRE-1α(p-IRE-1α)、磷酸化PERK(p-PERK)和转录激活因子6(ATF6)]、凋亡蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase 3)]、内...     

同型半胱氨酸经内质网应激介导小鼠心肌损伤

目的:旨在探讨同型半胱氨酸(Hcy)是否对心肌有损伤作用及其可能机制。方法:5周龄ApoE基因敲除小鼠27只,将其随机分为:对照组、高蛋氨酸组(HM组)、4-苯基丁酸组(4-PBA组),每组9只。对照组给予普通小鼠维持饲料喂养,HM组给予HM饲料喂养,4-PBA组经HM饲料喂养16周后给予腹腔注射4-PBA。所有小鼠继续原饲养方法喂养12周后处死,检测小鼠血清Hcy水平,光镜下观察心肌组织结构,电镜下观察心肌细胞超微结构,免疫组化及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激相关蛋白表达。结果:HM组和4-PBA组分别与对照组比较,血清Hcy水平均升高,差异均有统计学意义(P均0.05),4-PBA组与HM组Hcy水平差异无统计学意义(P0.05);光镜下三组小鼠心肌组织结构无明显差异。电镜下观察各组小鼠心肌细胞内质网形态,HM组内质网明显肿胀、排列紊乱,4-PBA组内质网肿胀及紊乱较HM组减轻。心肌组织切片行免疫组化检测内质网氧化还原酶α(ERO1α)表达,与对照组比较,HM组和4-PBA组表达明显增多,差异均有显著性统计学意义(P均0.01),4-PBA组较HM组表达减少,差异有显著性统计学意义(P0.01)。Western blot检测内质网应激相关蛋白表达,结果示,与对照组比较HM组胰腺内质网激酶(PERK)、激活CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、ERO1α表达均增加;与HM组比较,4-PBA组PERK、CHOP、ERO1α表达较HM组明显下降,各因子差异均有统计学意义(P均0.05)。结论:Hcy是心肌损伤的危险因素,通过内质网应激介导心肌细胞损伤,而4-PBA抑制内质网应激减轻高Hcy所致的心肌损伤。     

高同型半胱氨酸血症通过内质网应激抑制ApoE敲除鼠肾脏CFTR的表达

目的探讨高同型半胱氨酸血症通过内质网应激抑制载脂蛋白E基因敲除(Apo E-/-)鼠肾脏囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)的表达。方法实验分组:正常对照组(n=6):选择健康5周龄雄鼠(SPF级C57BL/6J),饲以正常饮食。另选5周龄雄性纯合子Apo E-/-鼠(SPF级近交系c57BL/6)18只,随机分为3组,每组6只:Apo E-/-对照组、高蛋氨酸组、干预组,分别给予正常饮食、高蛋氨酸饮食、高蛋氨酸饮食加0.006%叶酸及0.0004%维生素B12。喂养14周后眼球取血,分离血清,用酶联免疫吸附法检测血清同型半胱氨酸水平;实时定量荧光PCR检测小鼠肾脏CFTR、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、C/EPB同源蛋白(CHOP)mRNA的表达以及免疫组织化学法检测小鼠肾脏CFTR蛋白的表达。结果Apo E-/-对照组、高蛋氨酸组及干预组中血清同型半胱氨酸水平均增加,其中以高蛋氨酸组增加最显著(P0.01)。实时定量荧光PCR结果显示,高蛋氨酸组CFTR mRNA的表达较正常对照组和Apo E-/-对照组显著降低(P0.01,P0.05),干预组CFTR mRNA的表达较高蛋氨酸组显著增加(P0.01);免疫组织化学法检测CFTR蛋白的表达与其mRNA的表达变化一致。高蛋氨酸组GRP78、ATF6、PERK、CHOP mRNA的表达较正常对照组和Apo E-/-对照组显著增加(P0.01),干预组GRP78、ATF6、PERK、CHOP mRNA的表达较高蛋氨酸组显著降低(P0.01)。小鼠肾脏GRP78、ATF6、PERK、CHOP mRNA表达与CFTR mRNA表达的相关系数分别为:r=-0.7192,P0.01;r=-0.5501,P0.01;r=-0.7772,P0.01;r=-0.6785,P0.01。结论高同型半胱氨酸血症可能通过内质网应激抑制Apo E敲除鼠肾脏CFTR的表达。     

雌激素抑制内质网应激引起的血管内皮细胞凋亡及机制

目的通过建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内质网应激(ERS)的细胞模型,研究雌激素抑制内质网应激引起的凋亡的信号传导机制,以探讨雌激素对心血管的保护机制。方法分别用10μmol/L的衣霉素(TM)或2 mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)诱导HUVEC,建立内质网应激细胞模型,提前给予10-8mol/L的17-β雌二醇(E2)预处理1 h,用Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)判断模型是否建立成功,并探索E2对内质网应激的作用。检测内质网应激的三条主要信号通路蛋白的变化,上调最显著的为内质网应激最主要的信号通路。Western blot检测内质网应激凋亡蛋白C/EBP-同源蛋白(CHOP),Hochest染色检测细胞凋亡率,探索E2对内质网应激凋亡的作用。添加E2受体拮抗剂ICI182780(ERα、ERβ拮抗剂及GPER激动剂)和G15(GPER拮抗剂)后检测内质网应激最主要通路蛋白表达量的变化,探索雌激素受体在其抑制内质网应激中的作用。添加E2受体后信号通路阻断剂,检测雌激素抑制内质网应激的过程中活化其受体后激活的最主要受体后信号通路。结果 TM/DTT组GRP78的表达量显著上调,内质网应激三条信号通路中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)信号通路上调最明显,而TM/DTT+E2组上调显著回复。TM/DTT组CHOP的表达量显著上调且细胞凋亡率显著增加,而TM/DTT+E2组上调明显回复,凋亡细胞减少。E2有显著抑制p-PERK/PERK上调的作用,而E2的保护作用可分别被ICI182780和G15阻断,同时添加ICI182780和G15时阻断作用最显著。分别添加信号通路阻断剂后,E2抑制pPERK/PERK上调的作用均减弱,其中以磷脂酰肌醇-3羟基激酶(PI3K)通路阻断剂的作用最显著。结论 E2可抑制TM/DTT诱导的HUVEC内质网应激。p-PERK/PERK通路可能为TM/DTT诱导的HUVEC内质网应激最主要的信号通路。E2可抑制过度内质网应激引起的细胞凋亡。E2受体在E2抑制内质网应激凋亡的作用中起重要作用。E2受体激活包括PI3K-蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38-丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)在内的信号通路快速起到抑制内质网应激的作用,其中PI3K-Akt通路可能为最主要的通路。雌激素通过抑制PERK信号通路引起的内质网应激凋亡,保护血管内皮细胞,其抑制内质网应激的机制主要为活化的雌激素受体激活PI3K/Akt通路。     

PERK/eIF2α通路在酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡中的作用

目的 探讨内质网类似激酶(PERK)/真核生物翻译起始因子(eIF)2α信号通路在酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡中的作用.方法 建立大鼠酒精性肝损伤模型.设4、6、10周和12周4个时间点,动态观察肝组织病理变化;流式细胞术检测肝细胞凋亡率;酶联免疫吸附法检测血清同型半胱氨酸(tHCY)水平;实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot检测肝组织PERK/eIF2α通路信号分子mRNA和蛋白的表达水平.多组样本均数的两两比较采用One-Way ANOVA分析.结果 4周时造模大鼠发生急性肝损伤改变,12周时则出现慢性肝损伤改变;6周时造模大鼠肝细胞凋亡率较正常组显著增加(P＜0.05),随着造模时间的延长,肝细胞凋亡程度逐渐加剧,12周时早期和总凋亡率分别达到26%和29%;自6周起,造模大鼠血清tHCY水平明显高于正常大鼠(P＜0.01);自4周起,造模大鼠肝组织eIF-2α蛋白发生明显磷酸化,12周时peIF-2α蛋白表达量上升了2.81倍(P＜0.01),葡萄糖调节蛋白(GRP) 78/Bip、GRP94、caspase 12和caspase-3则表现为过度活化,12周时基因和蛋白表达量分别为正常大鼠的4.70、12.95、3.83、4.05倍和3.93、6.93、9.88、3.31倍(P＜0.01).结论 PERK/eIF2α通路的活化与酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡的发生和持续发展密切相关.     

Bcl-2抑制剂S1通过内质网途径诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的机制

目的探讨Bcl-2抑制剂S1诱导小鼠黑色素瘤B16细胞凋亡的机制。方法实验分为对照组、S1低剂量组(S1 2.5μmol/L)、S1中剂量组(S1 5μmol/L)和S1高剂量组(S1 10μmol/L),MTT检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率、Western印迹检测内质网应激凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,S1可以明显降低B16细胞存活率,差异有统计学意义(P﹤0.05);给予S1后B16细胞凋亡率明显上升,同时Western印迹结果显示,内质网应激相关蛋白GRP78以及内质网应激-凋亡相关蛋白CHOP表达水平明显上升,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论小分子化合物S1可以通过内质网凋亡信号通路引起B16细胞发生凋亡。     

罗格列酮对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织Kruppule样因子6信号通路的影响

目的观察罗格列酮对NASH肝纤维化大鼠肝组织kruppule样因子（KLF）6及其下游靶基因TGFβ1信号通路的影响。方法36只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、高脂组和罗格列酮组,24周末处死所有大鼠,留取肝组织行HE和Massson染色,检测血清TG、游离脂肪酸、AST、ALT及HA、LN、CⅣ等,RT-PCR检测核转录因子KLF6、TGFβ1以及反映HSC活化的特异性标记α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的变化,免疫组织化学检测KLF6、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、α-SMA的蛋白表达。结果模型组大鼠24周末出现典型脂肪性肝纤维化,治疗组纤维化程度明显减轻和改善。模型组血清生物化学指标及肝纤维化指标均有不同程度增高,罗格列酮干预16周后上述各指标均见明显改善,两组间差异有统计学意义（P〈0.01）。RT-PCR显示模型组KLF6 mRNA（0.96±0.08）、TGFβ1 mRNA（0.91±0.07）和α-SMA mRNA （1.08±0.19）的相对表达量均明显上升,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）;治疗组则显示增高的上述基因呈不同程度的下降,差异有统计学意义（P〈0.01）。免疫组织化学显示罗格列酮组KLF6、α-SMA蛋白的表达较模型组减少,而PPARγ的表达较模型组增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论罗格列酮可以激活PPARγ,降低NASH肝纤维化大鼠肝组织核转录因子KLF6及其下游靶基因TGFβ1的表达,抑制HSC的活化,阻止肝纤维化形成,这可能是其发挥抗肝纤维化的作用之一。