尼古丁调控人牙周膜细胞自噬水平的实验研究

目的 探讨尼古丁对人牙周膜细胞（hPDLCs）自噬水平的影响。方法 选取因正畸治疗而拔除的前磨牙,采用组织块法分离培养hPDLCs。通过Western blot法筛选尼古丁影响hPDLCs自噬的最佳作用时间及浓度,使用透射电子显微镜（TEM）和免疫荧光染色法检测该作用时间及浓度下hPDLCs自噬体形成情况和自噬标志蛋白LC3的表达情况。结果 LC3Ⅱ蛋白表达在尼古丁作用的12 h内持续升高,从而确定12 h为最佳作用时间;LC3Ⅱ蛋白表达上调具有尼古丁浓度依赖性,1×10^-5 mol·L^-1为尼古丁最佳作用浓度。TEM和免疫荧光染色证实尼古丁在此浓度及作用时间下hPDLCs细胞质内自噬体的数量增加,自噬标志蛋白LC3表达升高。结论 在一定条件下,尼古丁能够上调hPDLCs自噬水平,为进一步研究细胞自噬与吸烟相关牙周炎的关系奠定了基础。     

细胞外信号调节激酶1/2信号转导通路调控牙周膜细胞成骨分化的研究

目的：探索细胞外信号调节激酶（ERK）1/2信号转导通路是否参与调控牙周膜细胞的成骨分化。方法???取体外培养的第3代牙周膜细胞进行研究。实验分为空白对照组、成骨诱导组和实验组（在成骨诱导培养基中加入10?nmol·L－1?ERK1/2磷酸化的抑制剂PD98059）。培养1周和3周后通过定量聚合酶链反应（qPCR）、碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色检测其成骨能力。结果?成骨诱导可促进牙周膜细胞中ERK1/2的磷酸化。培养1周后,抑制ERK1/2的磷酸化可上调成骨标志物Runx2、ALP和骨钙蛋白（OCN）的表达,与成骨诱导组相比较,OCN的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,Runx2、ALP的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。培养3周后,实验组牙周膜细胞成骨标志物Runx2、ALP和OCN的表达仍较成骨诱导组高,ALP染色和钙结节形成较成骨诱导组强,其中Runx2、ALP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）,OCN的表达差异也具有统计学意义（P<0.01）。结论 ERK?1/2信号转导通路参与了调控体外培养的牙周膜细胞的成骨分化。     

人参皂苷Rg3对涎腺腺样囊性癌SACC-M细胞的增殖和凋亡的影响

目的研究人参皂苷Rg3对涎腺腺样囊性癌SACC-M细胞的增殖和凋亡的影响。方法用终浓度为10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、150μg/m L、200μg/m L的人参皂苷Rg3处理SACC-M 24、48、72 h后,用MTT法、流式细胞仪检测和观察SACC-M细胞的生长抑制率和凋亡情况。Real-time PCR检测凋亡基因bax、caspase-3的表达。EMSA法检测NF-κB活性。结果10~200μg/m L的人参皂苷Rg3均可显著性抑制SACC-M细胞的增殖并诱导其凋亡;且200μg/m L的Rg3诱导的凋亡率最高,为88.69%;Real-time PCR结果表明人参皂苷Rg3可以显著性诱导凋亡基因bax,caspase-3表达水平的上升(P<0.05);EMSA结果表明人参皂苷Rg3可以抑制SACC-M细胞中NF-κB的活性。结论人参皂苷Rg3可能通过抑制NF-κB的活性,从而增加凋亡基因bax、caspase-3的表达,最终抑制SACC-M细胞的增殖并诱导其凋亡。     

人参皂苷Rg1/ADSCs辅以透明质酸为基质对兔颞下颌关节骨关节病的改善作用

目的:探讨人参皂苷Rg1/ADSCs辅以透明质酸为基质对兔颞下颌关节骨关节病的治疗效果。方法:32只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、对照组、实验组,每组8只。通过关节腔内注射木瓜蛋白酶法建立骨关节病模型,对照组与实验组造模成功2周后开始药物治疗。对照组关节上腔注射人参皂苷Rg1/ADSCs悬液0.6mL,实验组注射透明质酸/人参皂苷Rg1/ADSCs复合物0.6mL,每周1次。各组动物分别于用药第3、9周后处死,每次16只,每组4只。制备标本,行髁突软骨扫描电镜、组织学观察及实时定量PCR检测,采用SPSS17.0软件包对数据进行方差分析及t检验。结果:扫描电镜与组织学观察可见,实验组软骨病变区改善情况优于对照组。与模型组比较,实时定量PCR结果显示,实验组MMP-13表达与空白组相对持平但低于对照组,差异有显著性(P<0.05);实验组TIMP-1表达与空白组相对持平但高于对照组,差异有显著性(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1/ADSCs辅以透明质酸为基质对改善兔颞下颌关节骨关节病有明显作用。     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响

目的：研究尼古丁（nicotine）对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）中Fas/Apo-1（CD95）表达的影响。方法：采用组织块培养法培养原代人牙周膜成纤维细胞并传代取处于对数生长期的第6代细胞用于实验,采用浓度为2mg/L的尼古丁处理第6代牙周膜成纤维细胞72h,通过免疫组织化学染色法检测尼古丁对人牙周膜成纤维细胞中Fas表达的情况。结果：证实尼古丁作用于人牙周膜成纤维细胞后,胞膜中Fas/Apo-1（CD95）抗原呈阳性表达。结论：提示尼古丁可通过Fas系统这一途径导致人牙周膜成纤维细胞的凋亡,从而加重牙周组织破坏的程度和影响牙周组织的再生。     

IL-21通过Notch信号调控人牙周膜细胞RANKL表达和增殖的研究

目的:观察IL-21对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG的表达以及增殖活性的影响,以及Notch信号通路在其中的作用,探讨IL-21在根尖周炎骨破坏中的作用机制。方法:使用不同浓度(0、10、50、100 μg/L)的IL-21作用于人牙周膜成纤维细胞,并选择最佳刺激浓度IL-21(50 μg/L)处理人牙周膜成纤维细胞,观察不同的时间点(0、12、24 h),通过实时定量PCR和ELISA的方法检测细胞中RANKL/OPG的表达水平。同时使用实时定量PCR和Western-blot检测IL-21对人牙周膜成纤维细胞Notch1表达水平的影响。运用Notch信号的阻断剂GSI(5 μmol/L)预处理人牙周膜成纤维细胞后,再检测IL-21对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG的表达水平的影响。CCK8法测定各个实验组细胞增殖活性。结果:IL-21可显著提高人牙周膜成纤维细胞RANKL的表达水平,对OPG的表达无显著影响。IL-21显著抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖活性。结论:IL-21通过Notch信号通路上调人牙周膜成纤维细胞的RANKL表达,抑制其增殖活性。     

饥饿条件下活性氧通过PINK1/Parkin通路调控人牙周膜细胞的线粒体自噬

目的 探究人牙周膜细胞（hPDLC）在饥饿条件下活性氧（ROS）与PINK1/Parkin通路介导hPDLC线粒体自噬的具体机制。 方法 分离培养正常牙周组织的hPDLSC,利用Earle’s平衡盐溶液（EBSS）模拟饥饿环境诱导hPDLC线粒体自噬,利用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）抑制ROS生成以探讨ROS在hPDLC线粒体自噬的作用,利用环孢素A（CsA）抑制PINK1/Parkin通路以研究ROS与PINK1/Parkin通路在饥饿条件下激活hPDLC中的作用。采用流式细胞术及JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,检测线粒体膜电位;采用透射电镜观察线粒体自噬体的生成及线粒体形态变化;采用线粒体红色荧光探针定位线粒体,溶酶体绿色荧光探针定位溶酶体;采用DCFH-DA ROS荧光探针检测ROS生成强度;采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中线粒体自噬基因（Tomm20、Timm23）及PINK1/Parkin通路的表达水平,采用蛋白质印迹 （Western blot）检测细胞中线粒体自噬蛋白（Tomm20、Timm23）及PINK1/Parkin通路蛋白表达水平。 结果 EBSS饥饿作用30 min后,诱导激活hPDLC线粒体自噬的作用最强,ROS表达增加,且线粒体自噬相关基因（Tomm20、Timm23）下调（P<0.001）,PINK1/Parkin通路表达上调（P<0.001）。NAC抑制ROS的产生后,自噬被抑制,同时Tomm20、Timm23表达上调（P<0.001,P<0.05）,PINK1/Parkin通路表达下调（P<0.001,P<0.05）。而当CsA抑制PINK1/Parkin通路表达时（P<0.05,P<0.05）,自噬被逆转,同时Tomm20、Timm23表达上调（P<0.001,P<0.01）。 结论 ROS在饥饿条件下主要通过PINK1/Parkin通路增强hPDLC线粒体自噬。     

DZIP1通过影响Wnt/β-catenin信号通路促进口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭

目的 探究DZIP1通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔鳞状细胞癌增殖、迁移和侵袭的影响.方法 实时荧光定量PCR和Western blot检测DZIP1和Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达,CCK-8检测细胞活力,克隆形成实验检测口腔鳞状细胞癌(oral squamous cel...     

RhoE regulates actin cytoskeleton organization in human periodontal ligament cells under mechanical stress

ObjectivesRhoE and regulator of G-proteins signalling (RGS) 2 were identified as the up-regulated genes in human periodontal ligament (PDL) cells under compression. RhoE belongs to the Rho GTPase family, and RGS2, a novel family of GTPase-activating proteins, turns off the G-protein signalling. Rho family proteins have recently been known to regulate actin cytoskeleton dynamics in various cell types. In this study, we investigated the involvement of RhoE and RGS2 in the regulation of actin filament organization in the PDL cells under mechanical stress.MethodsHuman PDL cells were cultured and subjected to a static compressive force (3.0 g/cm²) for 48 h. To observe changes in the actin cytoskeleton and the expression of RhoE and RGS2 in response to mechanical stress, immunofluorescence analysis was performed. To examine the role of RhoE and RGS2 in actin filament organization, cells were transfected with antisense S-oligonucleotides (ODNs) to RhoE and RGS2.ResultsCompressive force caused a loss and disassembly of actin stress fibres leading to cell spreading. Immunocytochemical study revealed that RhoE and RGS2 expressions were induced by mechanical stress and localized in the perinuclear and in the cell membrane, respectively. The impaired formation of stress fibres caused by compressive forces was recovered by treatment with antisense S-ODN to RhoE to the control levels. However, addition of antisense S-ODN to RGS2 did not affect the stress fibre formation.ConclusionsThese results indicate that the loss and disassembly of stress fibres due to mechanical stress are mediating RhoE signalling, without the exertion of RGS2.     

周期性张应变对人牙周膜细胞迁移的影响

目的 探讨周期性张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)迁移的影响及其相关机制,为进一步了解机械力对hPDLC功能的影响提供资料.方法 应用FX-4000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLC施加周期性张应变,牵张幅度分别为10%和20%,加载时间为6 h和24 h,频率均为0.1 Hz,以未加载的静态细胞作为对照组,应用划痕法观察hPDLC的迁移,蛋白质印迹法检测hPDLC的基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的表达变化;用细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的特异性抑制剂PD98059预处理hPDLC后,在0.1 Hz、10%幅度条件下,加载6 h,检测细胞p-ERK1/2和MMP-9表达的变化.用细胞迁移划痕法观察加载10%和20%幅度张应变,观察24 h后PD98059和MMP家族的抑制剂强力霉素(doxycycline,DOX)对hPDLC迁移的影响.结果 细胞迁移划痕实验结果显示,牵张幅度和加载时间均可显著促进细胞迁移.与静态组相比,施加牵张幅度分别为10%和20%的张应变6 h后,hPDLC迁移变化不明显,但加载24 h后,10%和20%幅度的张应变均显著促进了hPDLC迁移(P<0.05),细胞迁移率分别为(45 ±8)%和(66±14)%,且20%比10%幅度牵张对细胞迁移的促进作用更显著(P<0.05).蛋白印迹法结果显示,周期性张应变促进了hPDLC的MMP-9表达.牵张幅度对细胞MMP-9的表达有显著影响(P<0.05),但加载时间对细胞MMP-9的表达无显著影响.ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2活化,而且可通过ERK信号通路明显抑制张应变诱导的细胞MMP-9表达.细胞迁移划痕实验还证实,加载幅度分别10%和20%的张应变24 h后,抑制剂PD98059和DOX均能有效抑制周期性张应变诱导的hPDLC迁移.结论 周期性张应变可通过激活hPDLC的ERK信号通路,促进细胞的MMP-9表达,从而诱导体外培养的hPDLC迁移.     

牙周膜相关蛋白1在人牙周膜细胞成骨分化过程中的表达

目的 研究牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）在人牙周膜细胞（PDLC）成骨分化过程中的表达变化,为明确PLAP-1 在牙周组织中的作用奠定基础.方法 酶消化法培养人PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源和PLAP-1 的表达,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）实验鉴定其成骨分化能力,定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其成骨分化过程中,PLAP-1、Periostin、RGD-CAP、RUNX2、OCN 和OPN mRNA 表达变化,Western blot 检测PLAP-1、RUNX2 和OCN 蛋白表达变化并进行统计分析.结果 培养的人PDLC 来源于间充质;人PDLC 矿化诱导21 d 后茜素红染色阳性,矿化诱导后7、14、21 d 时ALP 活性较对照组明显增高（P ＜ 0.05）,具有成骨分化能力;PLAP-1 免疫细胞化学染色阳性;定量RT-PCR 和Western blot 结果显示,人PDLC 在mRNA 和蛋白水平均表达PLAP-1,且mRNA 表达量随人PDLC 成骨分化过程发生变化,诱导14 d上调,诱导21 d 下调,较对照组有明显差异（P ＜ 0.05）,Western blot 检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 PLAP-1 在基因及蛋白水平均高表达于人PDLC,其表达量随人PDLC 成骨分化成一定模式,提示其参与调控牙周膜的功能与稳定,但其精细的调控功能还有待进一步深入研究.     

氟化钠对人牙周膜细胞增殖及矿化能力的影响

目的:观察氟化钠对体外培养的人牙周膜细胞增殖及矿化能力的影响,为氟添加入牙周组织工程药物中的应用提供依据.方法:原代培养并鉴定人牙周膜细胞,应用CCK8检测不同浓度NaF对hPDLCs增殖的影响,并筛选出4个浓度用于矿化实验.矿化条件下,将0、1×10-5、5×10-4和1×10-3 mol/L的NaF作用hPDLCs后,通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色和实时荧光定量PCR检测矿化能力及成骨相关基因的表达.采用SPSS20.0软件包对数据进行单因素方差分析.结果:5×10-5、1×10-4、5×10-4 mol/L的NaF均能促进hPDLCs增殖,且以5×10-4 mol/L效果最佳(P＜0.05).而1×104 mol/L的NaF碱性磷酸酶染色阳性面积最大、茜素红染色矿化结节数量最多(P＜0.05).RT-PCR结果根据时间、指标变化程度较大.结论:5×10-5、1×10-4、5×10-4 mol/L的NaF能促进hPDLCs的增殖能力,1×10-5 mol/L的NaF能提高hPDLCs的碱性磷酸酶活性及钙结节形成.     

辛伐他汀对人牙周膜细胞增殖和分化的影响

目的:研究辛伐他汀对人牙周膜细胞增殖和成骨分化的影响.方法:将第4 代人牙周膜细胞在条件矿化培养液中诱导培养,同时加入不同浓度的辛伐他汀(10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L),噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖情况,4-硝基苯基磷酸二钠盐(4-nitrophenyl phosphate,hexahydrate,PNPP)偶氮法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性.结果:辛伐他汀各浓度组均能促进人牙周膜细胞的增殖和分化,其中10-8、10-7、10-6 mol/L组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),10-7 mol/L的辛伐他汀组促进细胞增殖和ALP活性的作用最明显.结论:适宜浓度的辛伐他汀可有效促进人牙周膜细胞的增殖和成骨分化.     

低氧对人牙周膜干细胞骨向分化影响的实验研究

基因,如碱性磷酸酶、骨钙素和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表达,从而抑制了人牙周膜干细胞骨向分化.     

正畸力调控牙周膜干细胞成骨分化的动物实验研究

目的 研究不同正畸力值对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)分化的作用及机制.方法 分别用50 g、150 g力值建立大鼠牙齿移动模型,加力7d后分离培养PDLSCs,检测其生物学功能和分子信号通路.结果 相比对照组,加力7d后,50 g力值组大鼠第一磨牙近中移动...