Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化的影响

目的 研究Osterix（Osx）过表达对人牙周膜细胞受力后骨向分化的影响,探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法 采用组织块法培养人牙周膜细胞,用重组质粒pcDNA3.1 flag- Osx 转染人牙周膜细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法检测未转染组、转染空质粒组、转染Osx组细胞Osx mRNA和蛋白表达水平;并观察核心结合因子α1（Cbfα1）、碱性磷酸酶（ALP）、骨桥素（OPN）、骨钙素（OC）、骨涎蛋白（BSP）和a1（I）型胶原蛋白（Col I）的mRNA表达情况。3组细胞加载6 h离心力后,观察上述检测指标的变化。结果 转染24 h后,相对未转染组,转染空质粒组Osx mRNA和蛋白水平无明显变化（P>0.05）;而转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,同时5个成骨标志基因的mRNA表达亦均明显升高（P<0.05,P<0.01）。加力6 h后,3组Osx和成骨标志基因表达水平均明显升高,但是转染Osx组Osx mRNA和蛋白表达增强更加显著,增加量约为其他两组的2倍,其 ALP、OPN、OC、BSP和Col I的mRNA表达亦升高更显著。结论 Osx过表达可以促进人牙周膜细胞在机械力作用下向成骨样细胞分化。Osx可能通过调控多种成骨基因的表达,从而在正畸牙周组织的骨改建过程中发挥着重要的作用。     

成骨细胞分化相关转录因子及其调控机制

成骨细胞的分化成熟是骨形成的前提，在该过程中需要多种因素的参与和调控。骨形成相关转录因子是其他因素如生长因子、细胞因子和动力传导的中枢和靶向，在促使间充质祖细胞向功能性成骨细胞的转化过程中起着关键作用。本文将介绍几个常见的成骨相关转录因子：Runx2、Osterix、Msx1／2和Dlx5／6。     

Runx2基因转染对兔下颌骨牵张成骨的影响

目的 :探讨在兔下颌骨牵张成骨过程中,Runx2基因参与牵张过程对新骨再生的影响。方法 :选用32只新西兰白兔成功建立单侧下颌骨牵张成骨模型,随机分为实验组和对照组。牵张结束时,实验组牵张间隙内注入转染重组腺病毒(Ad5-Runx2),对照组牵张间隙内注入等体积无菌生理盐水。于牵张结束后4周末处死全部实验动物。利用组织学、影像学、双能X线(DXA)和生物力学分析等方法,对获取的下颌骨牵张标本进行检测分析。结果:三维CT重建、组织学及DXA结果证实,实验组牵张间隙内新骨生成、新骨密度和矿化含量均明显高于对照组;三点弯曲试验分析显示实验组牵张间隙最大载荷明显高于对照组。结论:Runx 2-in vivo基因治疗能够有效促进下颌牵张成骨过程中的新骨再生。     

成骨特异转录因子 Runx2 在去势大鼠正畸牙移动牙周组织中的表达

目的：研究成骨特异转录因子Runx2在去势大鼠正畸牙移动过程中牙周组织内的表达规律。方法：选用3月龄雌性未孕SD大鼠50只,随机分为去势组（OVX）与假手术组（Sham）各25只。全麻下行大鼠去势术或假手术,术后饲养3个月。构建大鼠上颌第一磨牙正畸牙移动模型,并分别于牙移动0d、1d、3d、7d与15d处死去势组大鼠和假手术组大鼠各5只,取上颌第一磨牙周围牙周组织,行H-E染色和免疫组织化学染色后观察正畸牙移动牙周组织的改建。结果：去势大鼠与假手术大鼠正畸牙移动过程中牙周组织的改建基本相似,即张力区以成骨为主,压力区以破骨为主。去势组大鼠牙移动15d张力区成骨细胞及压力区破骨细胞均显著多于假手术组大鼠（尸〈0．05）。大鼠正畸牙移动过程中牙周组织Runx2表达先升后降。牙移动1d、3d、7d张力区与压力区Runx2表达均显著高于0d（P〈0．05）,15d与0d则无显著差异。去势组大鼠牙移动牙周组织Runx2表达变化与假手术组大鼠基本一致,但是去势组1d压力区和7d张力区Runx2表达均显著高于假手术组大鼠（P〈0．05）。结论：去势大鼠正畸牙移动过程中的牙周组织改建符合正畸牙移动的基本规律,但其牙周组织的改建更为活跃。去势大鼠正畸牙移动牙周组织内Runx2的表达增强,这可能与活跃的牙周组织改建相关,其机制需进一步研究。     

成骨细胞分化相关转录因子及其调控机制

成骨细胞的分化成熟是骨形成的前提,在该过程中需要多种因素的参与和调控。骨形成相关转录因子是其他因素如生长因子、细胞因子和动力传导的中枢和靶向,在促使间充质祖细胞向功能性成骨细胞的转化过程中起着关键作用。本文将介绍几个常见的成骨相关转录因子:R unx2、O sterix、M sx1/2和D lx5/6。     

体外机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中转录因子Osterix的表达

Osterix（Osx）是前成骨细胞分化为功能性成骨细胞过程中一种关键性的转录因子。该研究旨在通过检测机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中转录因子Osterix表达的变化，揭示Osterix是否在机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中发挥作用。体外培养人牙周膜细胞，以离心机加力，加力时间分别为1、2、4、6、8和12h。     

人脂肪组织来源血管周干细胞成骨、成脂、成软骨分化能力研究

目的    研究从人脂肪组织中提取的血管周干细胞（human perivascular stem cells,hPSCs）的特点,并探讨其成骨、成脂及成软骨分化的能力。方法    采用流式荧光细胞分选技术（FACS）在12例行吸脂手术患者的脂肪标本中分选出人基质血管成分（human stromal vascular fraction,hSVF）和由周皮细胞（CD34-、CD146+、CD45-）与外膜细胞（CD34+、CD146-、CD45-）组成的hPSCs进行培养,比较其克隆增殖能力,然后将2种细胞进行成骨、成脂和成软骨诱导,诱导结束后分别进行茜素红染色、油红O染色和阿尔新蓝染色,并检测成骨诱导后的成骨相关基因mRNA表达。结果    hSVF和hPSCs均以纺锤形成纤维样细胞生长,hPSCs呈现出更快的融合趋势,且细胞形态更均一。hPSCs细胞相比于hSVF具有更强的克隆增殖能力（P < 0.05）。hPSCs细胞在成骨及成软骨方向比hSVF具有更强优势,而hSVF在成脂方向比hPSCs具有更强优势。成骨诱导后,hPSCs的成骨基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的相对表达量要明显高于hSVF（P < 0.05）。结论    hPSCs细胞具有干细胞的多项分化潜能,且其在成骨方向具有很强优势,可成为骨组织工程学中理想的种子细胞来源。     

rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨区骨保护素表达的影响

目的：通过动物实验,研究应用外源性rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨区骨保护素（osteoprotegerin,OPG）的影响。方法：在48只成年大耳白兔的一侧下颌骨前部行骨切开术,分别将空白胶原、rhBMP-2 1.5mg胶原复合物植入下颌骨切开处,用牵引器延长一侧下颌骨4mm,稳定期第1、3、7、14天,分别处死各组动物,取牵引区新生骨痂行组织学及OPG免疫组化染色。结果：下颌牵引延长后牵引间隙均有新骨形成,应用rhBMP-2 1.5mg效果好。免疫组化染色OPG主要定位于成骨细胞的胞浆中。在同一时间内,应用rhBMP-2组较对照组有显著性差异（P〈0.05）。结论：动物实验表明,rhBMP-2能促进兔下颌骨牵引成骨区新骨的生成。     

Dlx2在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用

目的:探讨Dlx2(distal-less homeobox 2)基因过表达对体外培养的小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 向成骨方向分化的影响.方法:构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序验证.体外病毒转染MC3T3-E1后,以嘌呤霉素行抗性筛选稳定细胞株,以RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中Dlx2的表达.应用实时定量PCR(RT-PCR)检测Dlx2过表达对部分成骨相关基因(ALP、OCN、Runx2、Msx2)表达的影响.以碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色法检测Dlx2过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.采用SAS 6.04软件包对数据进行随机设计的方差分析.结果:本实验成功构建Dlx2过表达的反转录病毒载体,测序正确.体外转染后筛选出Dlx2稳定高表达细胞株MC3T3-E1-Dlx2,其mRNA和蛋白表达量显著高于对照组.在成骨诱导过程中,MC3T3-E1-Dlx2细胞ALP值在第4、7、14d均高于对照组细胞,茜素红染色显示实验组较对照组和空白组染色深.Dlx2过表达在成骨诱导早期能显著促进ALP和Msx2的表达(P<0.05),晚期则上调OCN表达(P<0.05),而Runx2表达无明显变化(P>0.05).结论:Dlx2过表达上调AIP、OCN等成骨相关基因的表达.促进MC3T3-E1细胞的成骨分化.     

硫化氢在模拟正畸力作用下对牙周膜细胞Runx2表达的影响

目的 模拟正畸力作用下,观察不同浓度硫化氢(Hydrogen Sulfide,H2S)对人牙周膜细胞成骨相关因子Runx2表达的影响.方法 对人牙周膜细胞分别施加5％循环张力0、6、12、24、48h,通过Real-time PCR及Western blot检测成骨因子Runx2的基因及蛋白表达;观察加力与不加力时不同浓度H2S对Runx2基因表达的影响.并通过Western blot检测p38-MAPK信号蛋白的变化.结果 加力后Runx2基因表达升高,在加力24 h时最高;不论加力与否,H2S浓度为50 μM时促进成骨因子Runx2升高作用最明显;加力24 h,H2S浓度为50 μM时,检测信号蛋白p38-MAPK磷酸化水平明显升高.结论 在模拟正畸力作用下,H2S可引起人牙周膜细胞成骨因子Runx2表达升高,并且p38-MAPK信号通路参与H2S引起人牙周膜细胞成骨因子Runx2表达升高这一过程.     

GLUD1基因对人牙髓干细胞的体外增殖、分化和矿化的影响

目的:探索谷氨酸脱氢酶1 (Glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)基因在人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hPDCSs)体外增殖、成骨分化和矿化中的作用.方法:体外分离培养hPDCSs,利用慢病毒感染方式沉默GLUD1基因的表达,分别采用RT-PCR和Western免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的沉默效率.采用CCK8法检测细胞的体外增殖水平.对hDPSC进行体外成骨诱导分化培养,采用茜素红染色法检测矿化结节的形成,利用RT-PCR和免疫荧光染色分别检测Runx2、OCN基因的表达.采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hDPSCs经过成骨诱导分化培养后,GLUD1的表达量较对照组明显上升;hDPSCs经shGLUD1病毒转染后,GLUD1表达明显下调;沉默GLUD1表达的hDPSCs体外增殖能力减弱;经成骨诱导分化培养后,与对照组相比,矿化结节形成明显减少;成骨早期标志基因Runx2上调,成骨晚期标志物OCN在mRNA和蛋白水平均显著下调.结论:沉默GLUD1表达抑制hDPSCs的体外增殖和矿化形成,影响晚期成骨分化;GLUD1在hDPSCs的成骨分化中具有重要作用.     

siRNA沉默CPNE7基因表达抑制人牙周膜细胞的增殖及骨向分化

目的:探讨沉默CopineⅦ(CPNE7 siRNA)对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLs)增殖及骨向分化的作用及其可能机制.方法:体外分离培养hPDLs,采用脂质体转染法将沉默CPNE7的质粒pSUPER-CPNE7转染至hPDLs.采用RT-PCR和Western印迹法检测CPNE7的表达,ELISA检测CPNE7 siRNA对NF-κB活性的作用.给予10 μmol/L NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵盐(pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt,PDTC)预处理hPDLs 30 min,采用CCK8检测CPNE7对细胞增殖的影响,ELISA检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,RT-PCR和Western印迹法检测RUNX2、OSX和OCN的表达.采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析.结果:hPDLs经转染pSUPER-CPNE7,CPNE7表达下调,有显著性差异(P＜0.05).CPNE7 siRNA显著增强NF-κB的活性.与对照组(CON)相比,CPNE7 siRNA显著抑制hPDLs增殖,下调ALP活性及RUNX2、OSX和OCN的表达,给予PDTC促进hPDLs增殖,增强ALP活性并上调RUNX2、OSX和OCN的表达.结论:CPNE7 siRNA通过NF-κB通路抑制hPDLs增殖和骨向分化.     

P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用

目的：探讨P2X7受体（P2X7 receptor,P2X7r）在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法：选取就诊于贵州中医药大学第一附属医院的健康青年患者因正畸需要而拔除的前磨牙为实验材料,分离、培养人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）。取第4代hPDLSCs,分为A、B、C、D 4组,A组用常规培养液培养,B组用成骨诱导液培养,C组用成骨诱导液+100 nmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）溶液培养,D组用成骨诱导液+100 nmol/L P2X7受体特异性拮抗剂KN-62培养。7 d后,采用茜素红染色观察各组hPDLSCs成骨效果,采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）检测各组hPDLSCs成骨相关因子骨钙素（osteocalcin,OCN）、RUNX2 mRNA的表达量,采用RT-PCR检测各组hPDLSCs中P2X7r mRNA表达。采用SPSS 22.0软件包对结果进行统计学分析。结果：茜素红染色结果显示,B组和C组hPDLSCs细胞形态发生显著变化,逐渐由不规则形变为方形,出现灰白色钙化小结节。结节多呈板层状圆形或椭圆形团块,C组灰白色钙化小结节显著多于B组,而A组和D组钙结节量均很少。B、C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于A组（P<0.05）,C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于B组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著低于B、C组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量与A组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论： P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中发挥正调节作用。P2X7受体被ATP激活后,可促进人牙周膜干细胞成骨分化,这为临床上治疗牙周炎提供了新的方向。     

不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度黄芩苷对人根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAPs）成骨分化的影响。方法 选取具备稳定传代能力的第3代SCAPs,采用Live/Dead细胞荧光染色,检测细胞在0、10、20、50、100 μmol/L不同黄芩苷浓度干预培养24 h后的存活情况及细胞活力;然后将SCAPs分为普通培养基组（DMEM）和成骨诱导培养基组（ODM）,根据黄芩苷的不同浓度,将实验组分为5个实验亚组,依次为0、10、20、50、100 μmol/L,利用碱性磷酸酶（ALP）染色法和ALP定量检测法,研究不同浓度黄芩苷对SCAPs培养7、14 d早期成骨分化的影响。应用茜素红染色法,定量检测不同浓度黄芩苷对SCAPs培养21 d后成骨矿化的影响。利用MTT法,检测不同浓度黄芩苷对SCAPs生长的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果 活/死细胞荧光染色结果表明,经不同浓度药物干预处理后,细胞活力旺盛,无明显异常;但黄芩苷药物浓度高于50 μmol/L时,细胞死亡数目有上升趋势。ALP定量检测结果显示,ODM组诱导分化第14天时,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）,100 μmol/L浓度组的ALP活性显著低于对照组（P<0.05）。DMEM组培养14 d后,20 μmol/L浓度组的ALP活性显著高于对照组（P<0.05）。茜素红定量显示,ODM组中100 μmol/L实验组的A值显著低于对照组（P<0.05）;20 μmol/L的黄芩苷浓度组是促进SCAP生长的最适浓度。结论 高于50 μmol/L浓度的黄芩苷对SCAPs的成骨分化表现出明显抑制作用,而低浓度黄芩苷,尤其是20 μmol/L的黄芩苷对SCAPs成骨分化及细胞生长有促进作用。     

乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

目的：观察乳铁蛋白（lactoferrin,LF）对体外培养的人牙周膜细胞（HPDLCs）增殖、迁移和成骨分化的影响。方法：原代培养并鉴定人牙周膜细胞,稳定传代后用 MTT 比色法、Transwell 法及划痕试验检测浓度分别为0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白对牙周膜细胞增殖和迁移的影响;矿化条件下,0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白作用牙周膜细胞后,茜素红染色法和实时荧光定量 PCR 检测矿化能力及成骨相关基因的表达。结果：10、20μg／ml 乳铁蛋白均能促进 HPDLCs 增殖、迁移（P ＜0．05）。10、20μg／ml 乳铁蛋白组矿化结节数量增多（P ＜0．05）,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）表达量均有升高（P ＜0．05）。结论：乳铁蛋白能够促进人牙周膜细胞增殖、迁移与成骨分化。     

浓缩生长因子促人脐静脉血管内皮细胞成血管化作用研究

目的 研究浓缩生长因子（CGF）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和分化的作用。方法 取健康志愿者静脉血制成CGF,再用CGF制备浓缩生长因子提取液（CGFe）。体外培养细胞分为2%CGFe组、5%CGFe组、10%CGFe组和对照组。CCK-8和细胞周期实验检测各组细胞增殖活性;划痕实验检测内皮细胞迁移;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞血管内皮生长因子（VEGF）、趋化因子受体4（CXCR4）、血小板衍生因子（PDGF）mRNA表达量。结果 CCK-8法和细胞周期结果显示CGFe明显促进细胞增殖（P<0.05）,且增殖效应呈CGFe浓度依赖性,各组间均有统计学差异（P<0.05）;划痕实验中12 h时实验组划痕愈合效率明显高于对照组,且愈合效率与CGFe浓度呈正比（P<0.05）;CGFe明显促进VEGF、CXCR4、PDGF的mRNA表达量,促进效应与浓度呈正比（P<0.05）。结论 CGFe能有效促进HUVECs的增殖、迁移和成血管分化。