Akt调节切应力诱导骨髓间充质干细胞Bmi-1基因的表达

目的探讨流体切应力对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中Bmi-1基因表达的影响及可能的信号机制。方法原代体外分离培养大鼠BMSCs,应用平行平板流动腔系统,给BMSCs施加不同强度(0.5、1.5、3.0 Pa)和不同加载时间(1、2、6、24 h)的层流切应力,用实时定量RT-PCR法检测Bmi-1基因的表达水平,用免疫印迹法检测磷酸化Akt和ERK1/2的表达水平,利用Wortmannin(PI3K特异性抑制剂)、PD98059(ERK1/2 MAPK特异性抑制剂)信号阻断剂探讨信号转导途径。结果 BMSCs在1.5 Pa切应力作用1 h后Bmi-1基因表达即明显增强,24 h达高峰。不同强度切应力都会刺激Bmi-1基因表达,其中3.0 Pa最强。切应力能显著激活磷酸化Akt和ERK1/2表达。Wortmannin而不是PD98059可以明显抑制Bmi-1基因的表达。结论切应力可诱导BMSCs中Bmi-1基因表达,其表达量与刺激时间和切应力的强度密切相关,这种作用可能通过Akt信号调节。     

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。     

奥氮平对骨髓间充质干细胞成脂分化的作用及机制

目的探讨第2代抗精神病药物(SGA)奥氮平(olanzapine)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外脂肪分化的影响及其作用机制。方法培养小鼠BMSCs,MTT法检测不同浓度奥氮平对BMSCs增殖的影响;通过油红O染色观察细胞形态,Western blotting检测脂肪分化标志基因蛋白αP2和C/EBPβ的表达,Real-time PCR检测成脂相关基因Leptin、C/EBPα和TNF-α的mRNA表达情况;同时Western blotting检测Akt信号通路上下游相关分子的表达水平及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt特异性阻断剂对小鼠BMSCs脂肪分化的影响。结果 MTT法结果显示,20μmol/L奥氮平对BMSCs的毒性最小;油红O染色可见加入奥氮平的细胞内脂肪滴明显多于对照组;Western blotting结果显示,αP2和C/EBPβ的表达水平较对照组上升了36%(P0.01)和25%(P0.05);Realtime PCR结果显示,Leptin、C/EBPα和TNF-α的表达水平较对照组分别上升68%(P0.001)、79%(P0.01)和60%(P0.01),均具有统计学意义;Western blotting检测结果显示,p-Akt的含量明显高于对照组,磷酸化糖原合成激酶3β(p-GSK-3β)的表达随着p-Akt表达的增加逐渐减少;加入PI3K/Akt特异性阻断剂(LY294002)后αP2和C/EBPβ的表达受到抑制,细胞中的脂肪滴也明显减少。结论奥氮平可能通过促使PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化水平升高来促进小鼠BMSCs的脂肪分化。     

Snail基因沉默对转化生长因子-β1促进骨髓间充质干细胞迁移的抑制作用

目的 研究转化牛长因子Cβl(TGF-β1)对体外培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)侵袭力的影响和对Snail、基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的调节作用. 方法采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞.用免疫荧光法对培养第3代的细胞进行鉴定.用改良的Transwell小室检测不同浓度TGF-β1对细胞迁移力的影响;RT-PCR和免疫荧光法检测TGF-β1作用不同时间细胞Snail、MMP-2 mRNA表达以及Snail蛋白表达情况.用脂质体转染针对Snail基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA),Western blotting检测转染前后TGF-β1对Snail、MMP-2表达的影响. 结果密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs.免疫荧光检测显示,培养的细胞CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性;外源性TGF-β1对MSCs迁移力的促进作用具有剂量依赖性,在2μg/L时达到最高.Snail、MMP-2 mRNA及Snail蛋白表达明显增高.Snail基因沉默可以明显抑制TGF-β1对MMP-2表达的促进作用. 结论 TGF-β1可显著增加促进MSCs的MMP-2表达,从而促进其迁移能力,此作用是通过TGF-131对Snail表达的上凋实现的.     

TGF-β1激活的p38MAPK在TGF-β1上调人卵巢癌细胞PAI-1表达中的作用

目的:纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)在凝血、创伤修复、炎症和肿瘤转移中起重要作用。已有报道转化生长因子β1(TGF-β1)能通过Smad通路诱导PAI-1表达,但TGF-β1能否通过激活非Smad通路诱导PAI-1表达尚不清楚,因此本研究探讨了在卵巢癌细胞中TGF-β1激活的非Smad通路p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)与TGF-β1上调PAI-1表达的关系。方法:用10μg/L TGF-β1处理卵巢癌SKOV3细胞和HO-8910细胞后,采用real-time PCR和Western blotting的方法检测PAI-1的表达,用磷酸化p38MAPK的抗体和磷酸化ERK的抗体检测p38 MAPK和ERK的激活情况,用p38 MAPK和ERK的特异性抑制剂SB203580和PD98059分别抑制其活性后,检测PAI-1的表达。结果:TGF-β1在卵巢癌细胞中可明显上调PAI-1mRNA和蛋白的表达,并可快速激活p38 MAPK和ERK。用p38 MAPK的抑制剂可以明显抑制TGF-β1上调PAI-1表达,但是抑制ERK活性对TGF-β1上调PAI-1表达没有明显影响。结论:TGF-β1激活的p38 MAPK通路参与了TGF-β1上调PAI-1的表达。     

骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化中电磁场激活ERK通路的作用

背景：研究表明电磁场可调节骨髓间充质干细胞的增殖和分化,但其具体机制尚不清楚。 目的：从ERK信号途径探讨电磁场诱导大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化成骨的作用。 方法：取第3代生长良好的大鼠骨髓间充质干细胞,暴磁组给予15 Hz、1 mT的正弦波电磁场刺激,PD98059+暴磁组在电磁场刺激前给予20 μmol/L ERK阻断剂PD98059,PD98059组仅给PD98059不进行电磁场刺激,对照组正常培养。电磁场刺激后,收集各组细胞,Western blot法检测ERK通路的活性,MTT法检测细胞增殖活性,碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。 结果与结论：电磁场刺激后,细胞ERK1/2磷酸化水平、细胞的增殖活性、及碱性磷酸酶活性均明显升高(P < 0.01);PD98059可明显抑制ERK1/2磷酸化水平及细胞增殖活性的升高(P < 0.01),而在一定程度上提高细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.01)。说明电磁场刺激可通过激活骨髓间充质干细胞ERK信号通路,并且主要通过该途径促进骨髓间充质干细胞的增殖;而在脉冲电磁场促进骨髓间充质干细胞分化成骨的过程中,激活ERK信号通路所起的作用较小。     

骨髓间充质干细胞抑制转化生长因子-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞间质化

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)是否通过抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,进而发挥其抗纤维化的作用及其机制。方法培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN细胞,用5μg/L的TGF-β1诱导分化,并分为对照组、转化生长因子(TGF)-β1刺激组、BMSCs干预组。采用倒置相差显微镜观察RLE-6TN细胞的形态变化;免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的定位;Western blotting法检测E-cad、α-SMA、p-Smad3、Snail1蛋白的表达。结果在TGF-β1的诱导下,肺泡Ⅱ型上皮细胞逐渐向肌成纤维细胞发生形态改变,由上皮细胞的鹅卵石状变成间充质细胞的梭形或纺锤形,且伴随着上皮标志物E-cad表达降低,而间充质细胞标志物α-SMA表达上调;给予BMSCs干预后,间充质化有所抑制,表现于细胞形态趋于上皮型,且上皮标志物E-cad表达上调,间质标志物α-SMA表达减少。与对照组相比,TGF-β1刺激组p-Smad3、Snail1蛋白表达上调。给予BMSCs干预后p-Smad3、Snail1蛋白表达显著降低。结论 BMSCs可能通过阻断TGF-β1/Smad3信号转导通路,抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞向肌成纤维细胞的转化,从而抑制上皮细胞-间充质转化的进程。     

碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化

目的:探究碧萝芷对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肝星状细胞活化的影响。方法:5μg/L TGF-β1和不同浓度碧萝芷(0、10、25、50 mg/L)分别作用于LX-2细胞,在有或无自噬抑制剂3-MA和ERK抑制剂PD98059的情况下,用MTT法检测细胞活力的变化,Western blot实验检测α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平的变化。结果:与对照组相比,5μg/L TGF-β1组的LX-2细胞活力以及α-SMA、ColⅠ、TIMP-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、beclin 1、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平明显增加(P0.05)。而碧萝芷预处理能逆转上述效应,并呈现一定的剂量依赖性,50 mg/L碧萝芷的抑制效果最为显著(P0.05)。而且,与TGF-β1组相比较,50 mg/L碧萝芷、5 mmol/L 3-MA或者20μmol/L PD98059预处理下,TGF-β1诱导的LX-2细胞活力以及α-SMA和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达均明显下调(P0.05)。结论:碧萝芷通过下调ERK磷酸化及自噬水平抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞活化。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

ERK信号分子介导周期机械拉伸诱导的骨髓间充质干细胞增殖

目的 研究周期机械拉伸加载对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响及其相关力信号转导分子。方法 应用周期机械拉伸加载装置研究不同参数的周期机械拉伸加载对大鼠骨髓间充质干细胞生长的影响。RT-PCR法检测c-fos mRNA表达的变化,Western blotting分析细胞外信号调节激酶（ERK1/2）磷酸化水平及c-fos蛋白表达的变化。结果 适宜的机械拉伸加载可以明显促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖,在频率1 Hz、形变量10％、拉伸15 min且静止6 h的条件下可以使细胞数量增加到对照组的1.4倍,c-fos mRNA和蛋白的表达显著增加。Western blotting检测证实,周期性机械拉伸加载明显促进ERK1/2磷酸化,却不影响ERK1/2总蛋白（t-ERK1/2）的表达水平。抑制剂PD98059显著抑制了机械拉伸对细胞增殖的促进作用,同时抑制拉伸诱导的ERK1/2磷酸化及c-fos基因和蛋白的表达水平。结论 ERK1/2信号分子的活化在周期性机械拉伸加载调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖的过程中起着重要作用,且该通路可能通过转录因子的调节促进rBMSCs的增殖。     

Akt与ERK1/2在吡格列酮保护乳鼠心肌缺血再灌注损伤中的关系

目的:研究Akt与ERK1/2在吡格列酮保护乳鼠心肌缺血再灌注损伤作用中的关系。方法:体外培养1~3日龄的Wistar乳鼠心室肌细胞,通过缺氧3 h,复氧3 h,建立心肌细胞缺血再灌注损伤模型。实验分为空白对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+吡格列酮组(I/R+P组)、缺血再灌注+吡格列酮+Akt抑制剂mk2206组(I/R+P+MK组)、缺血再灌注+吡格列酮+ERK1/2抑制剂PD98059组(I/R+P+PD组)。应用免疫印迹和免疫荧光检测各组细胞p-Akt和p-ERK1/2的表达变化。结果:与I/R组比较,I/R+P组p-Akt和p-ERK1/2均增加;I/R+P+MK组的p-Akt显著减少,而p-ERK1/2却明显增加;I/R+P+PD组的p-ERK1/2显著减少,而p-Akt却明显增加。各组间总Akt和ERK1/2的表达无明显变化。结论:吡格列酮可激活Akt和ERK1/2对缺血再灌注的心肌有保护作用,该过程中Akt和ERK1/2相互之间有影响。     

Akt/GSK-3β介导高糖上调肾小管上皮细胞Snail1的表达

 目的：观察高糖对原代肾小管上皮细胞Snail1和蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（Akt/GSK-3β）信号通路的影响,探讨糖尿病肾病时Snail1表达的调节机制。方法：原代培养大鼠肾小管上皮细胞（RTECs）,随机分为正常糖对照组、高渗组和高糖组。Western blotting检测不同处理组 RTECs不同培养时点（30 min、2 h、12 h、24 h、48 h和72 h）Snail1、Akt1、GSK-3β、磷酸化Akt（p-Akt,Ser473）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β,Ser9）蛋白的水平。RT-PCR检测Snail1、Akt1和GSK3β mRNA的表达。RTECs以磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002（25 μmol/L）预处理50 min,再与高糖共同培养24 h,Western blotting检测上述指标蛋白的表达。结果：与正常糖对照组比较,高糖组RTECs Snail1和Akt1蛋白和mRNA的表达上调,p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达增加,但总GSK-3β蛋白和mRNA表达无变化。以LY294002处理后,高糖组RTECs Snail1、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表达水平较未处理高糖组明显下降,但LY294002不影响总Akt1和GSK-3β蛋白表达。结论：Akt/GSK-3β可能介导了高糖诱导的RTECs锌指转录因子Snail1的表达上调。     

P13K/Akt信号通路在白蛋白诱导肾小管上皮细胞转化生长因子β1表达中的作用

目的 研究白蛋白对人肾小管上皮细胞(HK-2)分泌转化生长因子β1(TGF-β1)的影响,以及P13K/Akt信号通路在这一过程中的作用.方法 体外培养HK-2细胞,分为对照组、白蛋白(BSA)组和白蛋白加抑制剂(BSA+Ly294002)组.分别于培养12、24、48 h后,用MTT法检测HK-2细胞的增殖;RT-PCR检测HK-2细胞TGF-β1 mRNA的表达;Western印迹测定HK-2细胞TGF-β1和磷酸化的PI3K(p-PI3K)、Akt(p-Akt)蛋白分泌.结果 白蛋白可明显诱导HK-2细胞增殖(P<0.05),诱导后12 hBSA组与对照组比较,TGF-β1 mRNA表达明显上调(0.472±0.025比0.233±0.021,P<0.05);TGF-β1蛋白明显上调(296±20.1比100±13.2,P<0.05);p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著增加(P<0.05).加Ly294002 12 h时HK-2增殖受抑制;48 h时TGF-β1 mRNA、蛋白和p-PI3K、P-Akt蛋白的表达也受到抑制(均为P<0.05).结论 白蛋白通过活化PI3-K/Akt信号转导通路诱导肾小管上皮细胞产生TGF-β1.     

肾素前体激活人肾系膜细胞ERK1/2诱导TGF-β的表达

目的:观察肾素前体(prorenin)能否激活体外培养的人肾系膜细胞(HRMCs)膜表面的肾素(前体)受体[(P)RR],从而活化细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路。方法:体外培养HRMCs。以血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻断剂olmsartan和血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)阻断剂PD123319孵育细胞,再以prorenin刺激细胞,并用ERK1/2抑制剂PD98059和HRP(handle region peptide)干预。用免疫蛋白印迹方法(Western blotting)和酶标记免疫吸附测定方法(ELISA)测定目的蛋白水平,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定mRNA水平。结果:Prorenin作用于体外培养的HRMCs后,在阻断AT1和AT2受体时,能激活(P)RR使ERK1/2磷酸化增强、转化生长因子(TGF-β)水平增高。这种ERK1/2信号通路的激活是(P)RR激活后效应,并可被ERK1/2信号通道阻断剂PD98059阻断。HRP不能阻断(P)RR激活所致的ERK1/2磷酸化,不能使TGF-β表达降低。结论:在体外培养的HRMCs中,prorenin能够激活(P)RR,使ERK1/2信号通道活化导致TGF-β水平增高。而HRP不能阻断(P)RR激活后ERK1/2的磷酸化及TGF-β表达的增多。     

PP60C-SRC/ERK1/2信号通路调节大鼠精原干细胞活性

目的 研究PP60C-SRC通过磷酸化的细胞外调节激酶1/2 (p-ERK1/2)调节体外培养的9日龄大鼠精原干细胞的活性。方法 用MTT观察反义C-SRC脱氧寡核苷酸(ODNs)及PD98059对精原干细胞活性的影响;用Western blot检测PP60C-SRC和p-ERK1/2的表达。结果 与空白对照组相比,10 ?mol/L反义C-SRC ODNs作用12 h后精原干细胞活性下降了8.1 % (P＜0.05),10 ?mol/L PD98059作用24 h后精原干细胞活性下降了9.4 %(P＜0.01)。反义C-SRC ODNs组PP60C-SRC、p-ERK1/2蛋白表达与空白对照组相比分别下降了33.8 %和45.3 % (均P<0.01);10 ?mol/L PD98059作用精原干细胞24 h后,p-ERK1/2蛋白表达下降了34.5 %。结论 PP60C-SRC可能通过p-ERK1/2蛋白而调节精原干细胞的活性。     

可卡因－苯丙胺调节转录肽激活ERK促进海马神经元合成BDNF

目的： 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路在可卡因－苯丙胺调节转录肽（CART）上调大鼠海马神经元脑源性神经营养因子（BDNF）表达中的作用。方法： 取18 d的SD大鼠胚胎（E18），分离海马神经元,体外原代培养7 d，以不同剂量CART处理细胞，用Western blotting方法分别检测不同处理时点p-ERK表达。再以ERK通路特异性阻断剂PD98059（25 μmol/L）预处理细胞，进一步观察CART对p-ERK表达及BDNF合成的影响。 结果： 同对照组比较，CART处理组海马神经元p-ERK表达明显增高（P<0.01），BDNF合成增加。PD98059能阻断内源性ERK磷酸化、也能阻断CART诱导的ERK磷酸化，同时抑制CRAT引起的BDNF合成。结论： CART通过激活ERK促进海马神经元BDNF的合成，从而发挥神经营养作用。     

bFGF对卵巢癌CAOV3细胞Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad表达的影响

目的研究bFGF调控卵巢癌CAOV3凋亡的信号通路及对Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad表达的影响。方法无血清饥饿诱导细胞凋亡。分为饥饿对照、bFGF、bFGF PD98059、bFGF Wortmannin组。流式细胞术、DNA Ladder检测细胞凋亡;Western印迹法检测ERK、PKB、Bad活性以及Bcl-2、Bax表达,RT- PCR检测Bcl-2、Bcl-xl mRNA变化。结果bFGF促进p-ERK、p-PKB、p-Bad、Bcl-2表达,抑制Bax表达及饥饿诱导的细胞凋亡。激酶抑制剂PD98059可抑制bFGF对ERK、Bcl-2、Bax的调节作用,Wortmannin可抑制bFGF对PKB、Bad、Bax的调控作用,二者均可阻断bFGF对凋亡的抑制作用。bFGF对Bcl-xl表达无影响。结论bFGF可能通过激活MEK/ERK、P13K/PKB信号途径通路调节Bcl-2、Bax、Bad表达,抑制饥饿诱导的卵巢癌CAOV3细胞凋亡。     

过表达Akt1对小鼠骨髓间充质干细胞生物学功能的影响

目的探讨Akt1过表达对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学功能的影响。方法雄性健康C57小鼠,鼠龄7~8周,体质量18~25 g。取该小鼠胫骨和股骨,利用BMSCs的贴壁生长能力进行分离,并对获取的细胞进行流式鉴定。构建Akt1-IRES-GFP逆转录病毒载体,感染BMSCs,并筛选、扩增Akt1过表达的BMSCs。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot测定转染Akt1表达情况。用不同浓度(0、10、50、100 ng/mL)的γ干扰素(IFN-γ)处理Akt1-BMSCs及BMSCs,采用四唑氮化合物(MTS)法绘制生长曲线,通过Ca2+依赖性磷脂结合蛋白/碘化丙啶(AnnexinV/PI)复染,观察不同浓度IFN-γ对Akt1-BMSCs及GFP-BMSCs细胞凋亡的影响。结果成功培养出小鼠BMSCs,高表达CD29、CD44、Sca-1,而不表达CD45、CD34,CD11b、CD31、FLK-1、MHC-Ⅱ。成功筛选并扩增出Akt1-BMSCs;RT-PCR显示,Akt1-BMSCs的Akt1基因表达量明显高于BMSCs(P0.01);Western blot显示,Akt1-BMSCs的总Akt1蛋白及磷酸化Akt蛋白均高于BMSCs。流式细胞仪检测Akt1-BMSCs及GFP-BMSCs的绿色荧光蛋白(GFP)的表达量均高于95%。细胞增殖及凋亡实验显示,在正常培养及高浓度IFN-γ(100 ng/mL)的刺激下,Akt1-BMSCs显示出了增殖及抗凋亡优势。结论 Akt1-BMSCs比相同代数的BMSCs在正常培养及高浓度IFN-γ(100 ng/mL)的刺激下增殖及抗凋亡能力增强,可用于进行下一步的研究。     

缓激肽对TGF-β1诱导的猪肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

 目的：研究缓激肽（BK）对转化生长因子 β1（TGF-β1）诱导的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及其可能机制。方法：原代培养猪PASMCs,采用CCK-8法测定BK对TGF-β1诱导的PASMCs增殖能力的影响,同时应用Western blotting检测PASMCs PI3K、p-Akt和p-ERK1/2表达的变化。结果：TGF-β1呈剂量依赖性促进PASMCs增殖（P<005）,BK显著抑制了TGF-β1诱导的PASMCs增殖（P<005）,而BK 2型受体（B2R）抑制剂HOE-140可以显著抑制BK的效应（P<005）;Western blotting结果显示,BK抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖主要是通过阻断PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化而实现。结论：BK显著抑制TGF-β1诱导的PASMCs增殖,此作用可能与其抑制PI3K/Akt和ERK1/2信号通路活化有关。     

碱性成纤维细胞生长因子经ERK信号通路抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡

目的:研究卵巢癌CAOV3细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)经MEK/ERK1/2信号转导通路对CREB、Bcl-2表达以及对细胞凋亡的影响作用。方法:无血清饥饿诱导细胞凋亡。分为对照组、bFGF组、bFGF PD98059组。Annexin-EGFP/PI荧光双染法检测细胞凋亡。Western印迹法检测ERK1/2、CREB以及Bcl-2蛋白表达。RT-PCR法检测Bcl-2的mRNA表达。结果:bFGF可抑制无血清饥饿诱导的细胞凋亡;时效依赖性地诱导ERK1/2活性增高、刺激CREB磷酸化、促进Bcl-2的mRNA及蛋白表达增加。bFGF作用CAOV3细胞15 min时ERK1/2活性达高峰;45 min时CREB磷酸化达峰值;Bcl-2的mREN表达高峰为6h,8h时蛋白表达最高。MEK1抑制剂PD98059可抑制bFGF的上述作用。结论:bFGF可能通过激活MEK/ERK1/2/CREB/Bcl-2信号转导途径抑制卵巢癌CAOV3细胞凋亡。