乙型肝炎病毒多表位治疗性抗原基因的合成、表达及抗原性研究

目的 研究乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗基因的合成、表达及其产物的抗原性。方法 设计、并合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT，克隆人融合表达载体pWR450-1，构建重组质粒PWR／BPT。在大肠杆菌中表达乙型肝炎多表位抗原蛋白并纯化该蛋白，并用Westerm-blotting方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果 成功构建了融合表达载体PWR／BPT，在大肠杆菌中表达出乙型肝炎多表位抗原蛋白，Westem-blotting检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论 HBV多表位治疗性抗原基因的设计是成功的，其在大肠杆菌中表达的重组融合蛋白具有良好的抗原性，可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。     

间日疟原虫多表位疫苗基因的设计、合成与酵母表达

目的针对疟原虫生活史复杂,蛋白种类多且具有期特异性,逃避宿主免疫机制健全,流行广泛等特点,构建间日疟多期多阶段多表位疫苗候选株。方法根据文献报道筛选间日疟有效保护性抗原表位,利用计算机模建技术进行组合、排列,演绎多表位肽基因,人工合成基因,构建酵母表达系统,甲醇诱导表达多表位肽。结果以间日疟原虫3个PvCSPT表位、1个PvCSPB细胞表位、2个PvMSP-19B细胞表位、2个PvDBP-Ⅱ保守序列、1个PvAMAB细胞表位和1个PvAMAT细胞表位,加入白喉毒素T细胞表位和Pan-DRTh细胞表位肽,设计合成了一条由786bp组成的间日疟原虫多表位肽疫苗基因(PvDBW);利用G418压力筛选得到多个高拷贝pPIC9K/PvDBW/P.pastoris菌株;用甲醇诱导后表位肽呈分泌性表达,表达量为80mg/L。结论成功地构建了间日疟原虫多期多阶段多表位疫苗pPIC9K/PvDBW/P.pastoris菌株,得到了分泌性表达的多表位肽,为探索间日疟原虫多期、多表位疫苗的可行性奠定了物质基础。     

乙型肝炎病毒重组抗原表位检测敏感性研究

目的:在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒(HBV)抗原表位,并对其诊断敏感性进行评价。方法:人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸(S124-147)的寡核苷酸序列,克隆入外源抗原表位表达载体系统FHV-RNA2-I3位点,构建重组质粒,在原核pET系统(BL21细胞)中表达。通过ELISA和West-ernblot检测表达产物的抗原性,并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗-HBs。结果:嵌和蛋白可与抗-HBs特异性结合,其ELISA检测抗-HBs阳性率为77.5%,Westernblot的为68%,而对照试剂盒的为62%。结论:在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性,有诊断应用价值。     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物，为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础。方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因，使其两端带有与载体pET32a相匹配的酶切位点，插入载体pET32a，酶切并测序鉴定后，转入大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量，Western-blot分析表达产物的免疫反应性。结果 该基因在原核表达系统中经诱导，得到了M，31000的可溶性融合表达产物。经Ni-NTA纯化，纯度可达90％以上。免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B36感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别。结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值。     

多表位疫苗生物信息学分析概述

疫苗接种是防治传染性疾病的一种有效的防治策略。安全、有效和低成本的疫苗是如今疫苗研究的追求目标。生物信息学和高通量测序的方法为疫苗研究带来了新的思路,通过生物信息学分析工具进行表位预测,分析出可以诱导有效的细胞免疫和体液免疫反应的优势表位参与疫苗构建,再综合其他方面的生物信息学技术评估最终构成新的多表位疫苗。本文主要从抗原选取、计算机表位预测、多表位的连接、蛋白三维构建及评估、分子对接、分子动力学模拟等方面对当前最主要的多表位疫苗研究策略进行综述,同时总结了多表位疫苗目前的研究情形和未来的发展。该策略已经应用于新冠病毒、疟疾及利什曼原虫等病原体的多表位疫苗研究之中。     

含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究

目的研制基于表位的SARS-CoV基因疫苗,为传统灭活或减毒疫苗提供有益的配伍选择。方法通过网络数据库结合生物软件分析的方法,确定可能在SARS-CoV感染过程中起重要作用并具较好抗原性参数的结构区域作为候选抗原表位,以密码子优化的方法提高表位串联蛋白的真核表达效率,构建了含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗。结果多表位串联基因接入真核表达载体后,可在真核细胞内高效表达。多表位嵌合SARS-CoV基因疫苗免疫小鼠后,可诱导融合蛋白特异的体液免疫反应。结论该基于多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗可以诱导抗体应答,为该疫苗的深入研究奠定了基础。     

HIV多抗原表位疫苗的构建

以CD8^＋的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和CD4’的辅助性T淋巴细胞（HTL）为介导的细胞免疫应答是有效地控制和清除包括HIV在内的多种病毒病原体的必备条件。因而，人们对于能够诱导CTL和HTL免疫应答的HIV-1疫苗的研究兴趣浓厚，使HIV疫苗很快由学术研究向商品开发和工业生产等领域过渡和延伸。     

结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定

目的:构建含有6个编码结核杆菌抗原HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位基因序列的重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:选取结核杆菌抗原Rv0309、Rv0173、Ag85A、Ag85C的6个HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,引入Th表位PADRE及木马肽序列,并以RVKR序列作为接头,合成全基因序列,经 PCR扩增后插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹鉴定重组表达蛋白.结果:成功构建了结核杆菌多表位蛋白的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为40 000的融合蛋白.结论:多表位融合蛋白的重组表达为进一步开发新型结核疫苗打下了基础.     

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的 获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法 以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET2a相匹配的酶切位点,插入载体pET2a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果 该基因在原核表达系统中经诱导,得到了M_r1000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B6感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论 弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.     

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的：探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：用分子设计的理论和方法，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以BALB/c(H-2^d)纯系小鼠为实验对象，进行体内免疫学功能研究。结果：所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论：提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，引入B-、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达

目的：构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达。方法：从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind〖KG-*3〗Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达。结果：PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达。结论：成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中的YMDD变异及其临床意义

目的　探讨拉米夫定在慢性乙型肝炎 (CHB)治疗过程中的HBV变异及其临床意义。方法　 86例CHB用拉米夫定治疗 (10 0mg ,1/d ,共治疗 10 4周 )。观察SB、ALT、凝血酶原活动度 (PA)、HBeAg、抗 -HBc和YMDD变异情况。 结果　治疗 5 2周和 10 4周 ,YMDD变异率分别为 11.6%和 3 0 .2 % ,变异者ALT >40U·L-1,未变异者ALT保持正常 ,无反复 ;有 6例在停药后 2 0～ 45d ,发生重症肝炎 ,但血清中未测出YMDD变异株。结论　随服用拉米夫定时间延长 ,变异率升高 ,停服拉米夫定后发生的重症肝炎与YMDD变异无明显相关性     

乙肝疫苗联合乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴传播的临床效果

目的：探讨乙肝免疫球蛋白（HBIG）和乙肝疫苗联合阻断乙肝病毒（HBV）母婴传播的疗效。方法：选择2014年12月~2015年12月间246例HBsAg阳性孕妇为研究对象,根据随机数字表法分为观察组及对照组,均123例。对照组仅新生儿单独接种乙肝疫苗,观察组孕妇及新生儿均联合接种乙肝疫苗和HBIG。结果：对照组及观察组新生儿中出现宫内HBV感染率分别为22.76%和9.76%,一年后对照组及观察组新生儿中HBV感染率分别16.26%和1.63%,两组间差异均存在统计学意义。对照组及观察组新生儿出生时及一年后对应HBsAb阳性率分别为8.13%、76.42%和27.64%、94.31%,两组差异存在统计学意义。结论：孕妇及新生儿乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗联合应用能够有效降低HBsAg阳性情况患者所产新生儿HBV感染率,同时能使新生儿对应的HBsAb转阳率有效提高,最终使HBV的传播阻断率提高。     

乙肝病毒adr型基因疫苗诱导小鼠体液免疫应答

目的：构建乙肝病毒adr型基因疫苗pCMVS2-S,观察其免疫小鼠的特异性体液免疫应答。方法：将构建的乙肝病毒基因疫苗注射于C57BL/6小鼠胫骨前肌肉,运用ELISA检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体。结果：注射基因疫苗1周后,血清中抗HBs抗体转阳,1个月后抗体达到高峰,并以高水平维持至少2个月。结论：基因疫苗pCMVS2-S诱导C57BL/6小鼠产生较好的体液免疫应答。     

靶向La的外源性microRNA抑制HBV复制和表达的实验研究

目的 设计并构建靶向La的microRNA表达载体,观察其对La基因的抑制作用,探讨其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法 以La为靶基因,设计并构建3个针对La不同位点的microRNA表达载体,通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR和Western blot检测其对La mRNA和蛋白的抑制作用...     

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法 根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不合CpG的片段.用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定.结果 乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp.所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(1ss)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pzeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确.结论 成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss).为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础.     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究

追踪随访８１例乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）阳性母亲所生婴儿，乙肝病毒宫内感染率为１３．６％，对国产血源性疫苗阳性反应率为８６．４％，通过分析母血ＨＢＶ标志，发现；（１）母血中ＨＢｓＡｇ高滴度，ｅ抗原阳性是宫内感染的重要危险因素；（２）宫内感染与婴儿免疫无应答有关。