胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的 观察融合蛋白胞质转导肽(CTP) -HBcAg18-27 -Tapasin诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞(DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法 体外分离、培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养5d,再加入脂多糖诱导成熟.10 μg/L CTP HBcAg18-27-Tapasin、50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin、10 μg/L CTP-HBcAg18-27及RPMI-1640培养液加入培养介质.流式细胞术测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞术检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.结果 成功体外诱导小鼠髓源性DC; CTP-HBcAg18-27Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体Ⅰ分子的表达;50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL 12p70水平为(61.12±10.25)pg/mL,依次高于10μg/LCTP-HBcAg18-27 -Tapasin组的(50.43±10.42) pg/mL、10μg/L CTD HBcAg18-27组的(40.17±8.54) pg/mL和空白组的(30.51±8.03) pg/mL(F=15.85,P=0.030和P=0.037);CTP HBcAg18-27-Tapasin诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组;流式细胞仪检测融合蛋白诱导的CTL水平50 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(2.05±0.41)％、10 μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组为(1.06±0.10)％,高于10 μg/L CTP-HBcAg18-27组的(0.45±0.11)％和空白组的(0.09±0.02)％(F- 60.22,P=0.003).结论 CTP- HBcAg18-27-Tapasin可以促进DC的分化、成熟,增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力并能增加CTL的表达.     

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10μg/mL CTP-HBcAg18-27、10μg/mL HBcAg18-27-Tapasin及空白组RPMI1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC;CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)];流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.     

CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达载体的构建及其表达和纯化

目的构建CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合基因表达质粒并分离、纯化融合蛋白。方法以质粒pCMV-SPORT6中Tapasin基因为模板,设计一对引物,上游引物带有融合基因CTP-HBcAg18-27序列,进行PCR反应;PCR产物回收纯化克隆到质粒pREST-B中,双酶切及测序鉴定;将鉴定正确的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;镍柱亲和层析法纯化融合蛋白;Western blotting鉴定融合蛋白。结果由质粒pCMV-SPORT6 PCR扩增得到1 480 bp大小的条带,为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合序列;将其克隆到表达质粒pREST-B后经酶切、测序结果正确;表达质粒转化DE3后成功表达,经纯化得到52.3 KD的蛋白;Western blotting鉴定为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白。结论成功构建了CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达质粒,并成功表达,为进一步研究此融合蛋白的功能提供了实验基础。     

PTD-HBcAg融合蛋白诱导特异性CTL抑制转基因小鼠HBV复制

目的:探讨经PTD-HBcAg融合蛋白体内诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用.方法:20只HBV转基因小鼠随机分组, 融合蛋白PTD-HBcAg及对照蛋白HBcAg经皮下免疫小鼠, 每周1次, 共3次. 流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平; 微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平; 荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBV DNA水平; 肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.结果:PTD-HBcAg融合蛋白免疫转基因小鼠后, 能有效上调特异性CTL数量, 肝组织中炎性细胞的数量明显增多, 同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平有明显的抑制作用.肝组织HBsAg免疫组织化学蛋白平均吸光度分析显示, 50 μg和100 μg PTD-HBcAg融合蛋白组中平均吸光度值与空白组和50 μg HBcAg组相比明显降低(127.77±4.92, 117.71±5.18vs 156.84±4.94, 138.70±5.92, 均P<0.05), 且组间比较差异有统计学意义.结论:PTD-HBcAg融合蛋白免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量, 显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平, 同时抑制肝脏中HBsAg的表达, 在HBV免疫治疗中具有抗病毒作用.     

CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin诱导C57BL/6小鼠HBV特异性CTL反应的机制

目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg_(18-27)-Tapasin通过介导JAK/STAT通路诱导近交系C57BL/6小鼠HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组:CTPHBcAg_(18-27)-Tapasin实验组、CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin+AG490对照组、AG490对照组、PBS空白组.融合蛋白经肌肉注射免疫小鼠,腹腔注射AG490阻断JAK/STAT通路,CCK-8比色法检测T淋巴细胞增殖活性;流式细胞术检测T淋巴细胞内的的细胞因子;ELISA检测T淋巴细胞分泌细胞因子,Real-time PCR检测JAK/STAT通路信号分子表达水平.结果:CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组相比CTPHBcAg_(18-27)-Tapasin+AG490组CD8~+IFN-γ~+T双阳性细胞百分比显著增加(P0.01),淋巴细胞增殖活性差异具有显著性(P0.01),Th1型细胞因子分泌水平显著增加(P0.01),其他各组之间没有显著性差异,JAK/STAT信号通路信号中Jak2,STAT4 mRNA分子表达水平CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组相比其他对照组表达水平差异具有显著性(P0.05),CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组Tyk2、STAT1mRNA的分子表达水平相比其他对照组表达水平具有显著性差异(P0.01).结论:本研究表明CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin通过JAK/STAT信号通路促进Th1型细胞因子的分泌而促进特异性CTL反应.     

热休克蛋白70-HBcAg(18～27)蛋白复合物对乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫研究

目的研究结核杆菌热休克蛋白(HSP)70-HBcAg(18～27))蛋白复合物对HBV转基因小鼠免疫应答的影响。方法体外构建HSP70-HBcAg(18～27)蛋白复合物,以HBV转基因小鼠为实验对象,进行体内免疫学功能研究。结果HSP70-HBcAg(18～27)蛋白复合物使HBV转基因小鼠外周血及脾中CD4~ T淋巴细胞和CD8~ T淋巴细胞大量增殖,诱导较强的抗原特异性CTL应答,并活化自然杀伤细胞、树突状细胞参与应答反应。结论HSP70-HBcAg(18～27)蛋白复合物具有免疫原性,能够增强转基因鼠细胞免疫应答能力,有望作为蛋白疫苗用于慢性乙型肝炎的免疫治疗。     

急性乙型肝炎患者特异性核心抗原细胞毒性T淋巴细胞频率的变化及其意义

目的 动态观察急性乙型肝炎(AHB)患者外周血HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、血清ALT、HBV DNA、HBsAg和淋巴细胞亚群的变化,探讨HBV特异性CTL频率的消长在病毒清除以及肝脏损伤中的作用.方法 分别选取AHB、慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血,根据人类白细胞抗原(HLA)-A0201结果分为两组:HLA-A0201阳性患者作为HBV特异性CTL检测组、HLA-A0201阴性患者作为特异性抗原表位对照组.用HLA-A0201限制性表位HBcAg18-27五聚体复合物通过流式细胞技术,动态定量检测外周血中HBV特异性CTL频率和T、B淋巴细胞与自然杀伤细胞(NK)和NKT淋巴细胞;以速率法检测血清ALT水平;荧光定量PCR检测HBV DNA水平; Abbott微粒子化学发光技术检测HBV血清学标志物.计量资料采用均数±标准差((x)±s)表示或中位数(P25-P75)描述,组间比较采用方差分析或非参数检验(KruskalWallis检验和Mann-Whitney U检验);两种计量指标的关系采用Pearson相关分析.结果 AHB患者入院第1、2、3周外周血HBcAg表位特异性CTL频率分别为2.11%(0.20%～3.64%)、3.56%(1.05%～5.91%)、2.03%(0.33%～3.58%),高于入院第4、5、6周的0.99%(0.12%～2.16%)、0.29%(0.05%～0.76%)、0.39%(0.05%～0.46%),也显著高于CHB的0.11%(0.06%～0.29%),z值分别为-3.258,-4.041,-3.259,P值均＜0.01.AHB患者HBcAg表位特异性CTL峰值延迟于血清HBV DNA、HBsAg和ALT等指标的峰值;在AHB患者中,HBcAg表位特异性CTL高频率患者的血清HBsAg消失时间早于CTL频率较低的患者[(1.75±1.04)周与(4.33±3.51)周,t=-2.018,P＜0.05].CD3+CD8+T淋巴细胞频率的峰值出现在入院后第2周,并与HBcAg表位特异性CTL峰值相重叠,两者动态变化规律呈相关性(r=0.420,P＜0.01).AHB患者早期外周血NK、NKT淋巴细胞数量显著低于正常对照组和CHB患者,但随着病情好转而逐渐恢复,AHB患者外周血NK细胞数量变化与HBcAg特异性CTL动态变化呈负相关(r=-0.435,P＜0.01).结论 急性HBV感染者高频率的HBcAg表位特异性CTL与HBsAg的更早消失有密切关系,动态监测外周血中HBcAg特异性CTL频率变化,可以作为预测HBV感染后临床转归的参考指标;AHB患者外周血CD8+T淋巴细胞数量的变化,可以间接反应AHB患者体内HBcAg特异性CTL频率的改变.

Abstract：

Objective This report aims to investigate the dynamical changes of HBcAg18-27 epitope specific cytotoxic T lymphocytes(CTL), alanine aminotransferase (ALT), HBV DNA and HBsAg in peripheral blood of acute hepatitis B patients, and to explore the roles of HBcAg18-27-specific CTLs in virus clearance and liver injury. Methods Acute hepatitis B (AHB) and chronic hepatitis B (CHB) patients were divided into two groups according to results of HLA-A0201. Patients with positive HLA-A0201 were classified into HBcAg-specific CTL group and those with negative HLA-A0201 were referred as control group.The specific CTLs were stained with HLA-A0201 limited HBcAg18-27 epitope MHC-Pentamer and the frequencies of CTLs, T, B, NK and NKT cells were detected by flow cytometry (FCM). The serum ALT, HBV DNA and HBsAg were examined using speed analysis, quantitative PCR and abbott chemiluminescent technology. Results The frequencies of HBcAg18-27-specific CTLs in AHB patients were higher in the early three weeks as compared to the late three weeks. The apex time of HBV-specific CTL frequencies lagged behind those of HBV DNA, HBsAg and ALT. The loss of HBsAg in patients with high frequencies of HBVspecific CTL was earlier than that in patients with low frequencies (t = 2.018, P ＜ 0.05). In the second week the peak frequencies of CD3+CD8+ cells overlapped with that of HBcAg18-27-specific CTLs and with a positive correlation between (r = 0.420, P ＜ 0.05). During the early stages of AHB, the frequencies of NK and NKT cells were found significantly lower than that of control group and CHB group and the levels were back to normal after recovery. Moreover, a negative correlation existed between the frequencies of NK cells and the dynamic changes of HBcAg18-27-specific CTLs (r = -0.435, P ＜ 0.01) in AHB group. The frequencies of HBcAg18-27-specific CTLs were significantly higher as compared to CHB group in the first three weeks (z = -3.258, -4.04, and -3.259, P ＜ 0.01). Conclusion The early loss of HBsAg was closely related to the high frequencies of HBcAg18-27 specific CTLs in AHB patients. HBcAg-specific CTL frequencies in peripheral blood could be used to predict clinical outcome after HBV infection. The frequencie of CD8+ T cells can reflect the changes of frequencies of HBcAg-specific CTL. during acute HBV infection.     

乙型肝炎病毒前C/BCP区基因变异对特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫应答的影响

目的 研究HBV前C/BCP区基因变异对慢性乙型肝炎(CHB)患者特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答的影响.方法 采用HBV核心抗原表位肽core18-27,流式细胞术胞内细胞因子(CFC)分析法检测CHB患者外周血单个核细胞(PBMC)中的特异性CTL,对扩增产物进行测序分析.结果 54例CHB患者中G1896A突变毒株21例,占38.9%;1762/1764位核苷酸联合突变26例,占48.1%;3位点同时突变毒株13例,占24.1%.3种变异株体外HBV核心抗原表位肽core18-27刺激后,特异性CTL水平[(0.41±0.09)%、(0.36±0.08)%、(0.48±0.08)%]显著高于野毒株[(0.11±0.06)%,P＜0.05].结论 G1896A变异及1762/1764位核苷酸联合突变能显著增强特异性CTL水平,在CHB患者病情活动过程中起重要作用.     

乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞应答与不同临床感染状态的关系

目的 分析人类白细胞抗原(HLA)-A0201限制性的特异性CTL,研究急性肝炎急性期和慢性乙型肝炎活动期患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异.方法 收集HLA-A0201阳性的5例急性肝炎急性期和6例慢性乙型肝炎活动期患者的外周血单个核细胞(PBMC),酶联免疫斑点技术(ELISPOT)测定针对HBV聚合酶区(Pol575-583)、包膜区(Env348-357)和核心区(Core18-27)3个CD8+T淋巴细胞表位肽特异性CTL的数量和功能.数据采用t检验.结果 经Pol575-583、Env348-357和Core18-27三条抗原肽刺激,急性乙型肝炎急性期患者组斑点形成细胞数(SFC)分别为110±13、165±17和185±20;慢性乙型肝炎活动期患者组SFC分别为22±4、23±5和30±5,两组差异有统计学意义(t值分别为10.9、15.2和8.0,均P<0.05).急性乙型肝炎急性期患者各抗原肽特异性CTL的应答能力Pol575-5830.05).非特异性HLA-2402限制性Core117-125刺激也出现SFC增加,但与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 急性感染者HBV特异性CTL应答水平显著高于慢性HBV感染者,慢性乙型肝炎患者体内的多克隆CTL数量和功能低下.     

丁苯酞对急性动脉粥样硬化性脑梗死大鼠神经功能的影响

目的探究丁苯酞对急性动脉粥样硬化性脑梗死大鼠神经功能的影响。方法随机选择SPF级SD大鼠42只分为对照组,模型组和丁苯酞组(n=14),对照组使用正常饲料并暴露颈动脉不结扎,模型组和丁苯酞组建立动脉粥样硬化模型和脑梗死模型后给药。采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评估神经功能,检测外周血神经元特异性烯醇化酶(NSE)、内皮素1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白表达。结果模型组mNSS、脑梗死体积、凋亡指数、NSE和内皮素1水平明显高于对照组,血管数量、PI3K、Akt、VEGF mRNA和蛋白明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。丁苯酞组mNSS、脑梗死体积、凋亡指数、NSE和内皮素1水平明显低于模型组[(5.86±1.02)分vs(12.85±2.16)分,(14.38±2.43)%vs(36.45±4.78)%,(20.43±2.56)%vs(46.75±3.72)%,(11.24±1.53)μg/L vs(15.86±2.24)μg/L,(40.35±4.74)μg/L vs(51.17±6.21)μg/L,P0.05)],血管数量、PI3K、Akt和VEGF mRNA和蛋白明显高于模型组,差异有统计学意义(P0.05)。结论丁苯酞具有缓解动脉粥样硬化脑梗死引起的神经元凋亡作用,并可促进PI3K/Akt通路和血管生成。     

磷脂酰肌醇3-激酶γ对急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)对小鼠实验性急性胰腺炎胰腺腺泡细胞自噬作用的影响,并探讨其意义.方法 野生型C57 BL/6小鼠和PI3Kγ基因敲除小鼠各18只,按数字表法随机分为对照组(6只)和急性胰腺炎(AP)组(12只),采用蛙皮素50μg/kg体重腹腔内注射7次、每次间隔1h的方法制备AP模型.首次注射后7h处死小鼠,光镜下观察胰腺病理学变化,免疫荧光检测自噬泡主要组成蛋白LC3颗粒,荧光分光光度计测定胰蛋白酶活性,蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3-Ⅱ和p62的表达.结果 AP组野生型小鼠和PI3Kγ基因敲除小鼠的胰腺自噬空泡数量分别为(5.14±0.85)、(2.25±0.54)个/每高倍视野(HPF),LC3荧光免疫颗粒数量分别为(78.6±9.38)、(26.4±4.21)个/HPF,胰蛋白酶活性分别为(0.827±0.126)、(0.358±0.098) pmol/mg蛋白,各组间差异均具有统计学意义(P值均＜0.05).野生型小鼠的p62蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠显著减弱(0.11比0.92,P＜0.05),面LC3 -Ⅱ、beclin1蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠显著增强(1.82比0.93,1.43比1.05,P值均＜0.05).结论 AP时PI3Kγ可能通过增强小鼠胰腺腺泡细胞的自噬作用,促进胰蛋白酶原的活化及诱导腺泡细胞坏死.     

不同剂量HBV疫苗接种产生的细胞毒T淋巴细胞反应

目的研究不同剂量HBV疫苗接种产生的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)反应。方法100只BALB／c小鼠随机分为5组：0．65、1．25、2．5、5组小鼠腹腔分别接种0．65、1．25、2．5、5μg的HBV疫苗，其中一半小鼠2周后加强免疫1次：对照组小鼠同时按种5μg佐剂。分别在初次免疫后4周或加强免疫后2周，分离小鼠牌T淋巴细胞；体外用HBV疫苗特异性CTL表位多肽S28-39-刺激；用特异性多肽S28-39、^51Cr标记的P815细胞作为靶细胞；4小时^51Cr释放实验检测CTL反应。结果开始时随接种剂量增大CTL反应逐步增强，至1．25μg达到最大，以后又逐步减弱；加强免疫显著增强CTL反应。结论不同剂量HBV疫苗接种产生的CTL反应强弱不同，而且加强免疫能够提高CTL反应。     

信号素3A诱导培养大鼠皮质神经元凋亡与PI3K/Akt通路有关

目的 探讨外源性信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)对原代培养大鼠皮质神经元凋亡的影响和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,Akt)通路在Sema3A诱导凋亡中的作用.方法 体外培养新生Sprague-Dawley大鼠皮质神经元,并用微管相关蛋白-2免疫荧光染色鉴定.培养大鼠皮质神经元随机分为正常对照组和不同浓度Sema3A(500、1 000和2 000 μg/ml)组.CCK8法检测神经元存活率,Hoechst33342染色和TUNEL染色观察神经元凋亡,蛋白质印迹法检测P-Akt、Akt和Bcl-2表达.结果 培养的皮质神经元纯度达95％以上.CCK8检测显示,500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组细胞存活率分另为对照组的(80.9±5.3)％、(67.5±3.9)％和(50.2±4.4)％(F=165.042,P=0.000).Hoechst33342染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(22.4±1.2)％、(34.0±1.2)％、(39.3±1.4)％和(47.3 ±2.3)％ (F=103.237,P=0.ooo).TUNEL染色显示,正常对照组及500、1 000、2 000 μg/ml Sema3A组神经元凋亡率分别为(23.9±1.1)％、(31.9±1.0)％、(40.1±1.5)％和(51.4±3.4)％ (F=103.118,P=0.000).蛋白质印迹法显示,随着Sema3A浓度的增高,P-Akt(F=15.959,P=0.001)和Bcl-2(F=18.776,P=0.001)表达逐渐下调;而Akt表达无显著改变(F=0.590,P=0.639).结论 Sema3A主要通过诱导神经元凋亡而降低培养皮质神经元存活率,其机制可能与下调P-Akt和Bcl-2表达有关.     

PI3K/AKT信号通路在RANKL诱导的SGC-7901胃癌细胞迁移中的作用

目的文献报道RANKL/RANK/OPG途径与肿瘤细胞迁移及骨转移密切相关,但RANKL/RANK途径是否参与胃癌细胞迁移,尚无文献报道。本文拟检测RANK在胃癌细胞系SGC-7901细胞中的表达,并进一步探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在RANKL诱导的胃癌细胞迁移中的作用。方法 West-ern blot检测SGC-7901细胞表面RANK蛋白的表达;RANKL刺激后磷酸化Akt(P-Akt)及Akt的表达;Transwell法测定RANKL及抑制剂刺激后细胞迁移能力的改变。结果 SGC7901细胞表达RANK蛋白。RANKL(1μg/mL)诱导SGC-7901细胞迁移能力增强,迁移增加率为57.2%±5.9%,RANKL抑制剂rOPG(5μg/mL)显著抑制RANKL诱导的细胞迁移(13.88%±3.57%,P<0.05)。RANKL刺激后30 min～3 h,SGC-7901细胞p-Akt表达升高,应用PI3K的抑制剂LY294002(50 mmol/L)显著抑制RANKL诱导的胃癌细胞SGC-7901的迁移(57.28%±5.91%vs23.18%±2.79%,P<0.05)。结论胃癌细胞系SGC-7901细胞表达受体RANK,PI3K/Akt信号通路参与RANKL诱导的SGC-7901细胞迁移。     

心肌特异性高表达热休克蛋白27抑制阿霉素诱导的小鼠心肌凋亡

目的观察小鼠心肌特异性高表达热休克蛋白27(Hsp27)对于阿霉素(Dox)诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法野生型(WT)和心肌特异性高表达Hsp27的转基因(TG)小鼠,实验组和对照组(n=3)分别用Dox25mg/kg和等体积生理盐水进行一次腹腔注射,3d后取心脏,经TUNEL染色和蛋白印记分别观察心肌细胞凋亡及可诱导热休克蛋白(iHsps)的表达情况。结果Hsp27在TG鼠心肌中特异性高表达。Dox处理后WT和TG鼠的心肌细胞凋亡较对照组均显著增加,但TG的凋亡比WT显著减轻[(5.22±0.60)‰和(10.67±2.41)‰,P<0.01];Dox刺激后Hsp70和血红素加氧酶1(HO-1)表达增加,TG鼠表达水平要显著高于WT鼠[Hsp70:(1.793±0.237)和(1.013±0.14),P<0.01;HO-1:(6.884±1.104)和(4.385±0.463),P<0.05],而αB-晶体蛋白(αBC)在各组间没有显著差异。结论Hsp27心肌特异性高表达能够有效抑制Dox诱导的小鼠心肌细胞凋亡。     

乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的研究

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合表达质粒免疫乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠及其病毒清除作用。方法 将小鼠随机分为8组,分别注射以下质粒:A组pcDNA3.1-S 100μg;B组:pcDNA3.1-GM-CSF-S 100μg;C组:pcDNA3.1-S-GM-CSF 100μg;D组:pcDNA3.1-S 50μg pcDNA3.1-GM-CSF 50μg;E组:pcDNA3.1-GM-CSF 100μg;F组:重组酵母乙型肝炎疫苗1μg;G组:pcDNA3.1 100μg;H组:磷酸盐缓冲液(PBS)100μl。于质粒注射前4d肌肉注射0.25％bupivacaine溶液100μl,诱导骨骼肌细胞变性。以HBsAg和GM-CSF的融合乙型肝炎表达质粒免疫HBV转基因小鼠,检测HBV转基因小鼠血清HBsAg表达水平及肝细胞HBsAg的表达,检测脾细胞白细胞介素(IL)-2、IL-4及γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平及淋巴细胞增殖情况,并进行肝组织学检查。结果 质粒加强免疫4周后血清HBsAg检测结果A组为28.28±15.32、B组为10.77±9.18、C组为44.16±8.30、D组为21.93±13.28、E组48.04±3.60、F组为38.3±11.66、G组为47.03±3.96、H组为51.46±4.70,F=11.262,P<0.01,其中B组血清HBsAg滴度显著低于其余各组。IL-2分泌水平(pg/ml)A组为25.5±7.5、B组为48.5±11.3、C组为4.0±2.5、D组为38.0±8.5、E组为3.7±2.1、F组为6.5±23.     

乙型肝炎患者外周血病毒特异性CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞的数量和功能分析

目的 分析急性乙型肝炎(AHB)和慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中乙型肝炎病毒(HBV)特异性细胞毒性T淋巴细胞( CTL)的数量及功能.方法 36例HLA-A2阳性的乙型肝炎患者,其中AHB 12例,CHB 24例.分别用含HBV抗原C、S和P区的c18-27、s183-191和p575-583三个肽段的四聚体[Tetramer (Tc 18-27、Ts183-191、Tp 575-583)]检测患者外周血单核淋巴细胞(PBMCs)中HBV特异性CD8阳性CTL细胞的数量,同时用酶联免疫斑点法(EHSPOT)检测其分泌IFN-γ的功能.用SPSS 13.0进行统计学分析.结果 AHB和CHB患者外周血中Tc18-27特异性的CTL数量无明显不同;而Ts 183-191特异性CTL的平均值分别为0.24％±0.39％和0.03％±0.02％,阳性率分别为75％和33.3％;Tp575-583特异性CTL平均值分别为0.08％±0.09％和0.02％±0.01％,阳性率分别为50％和16.7％,AHB较CHB显著升高(P＜0.05).此外,AHB患者平均Tetramer阳性的个数为1.58个,而CHB患者平均为0.67个,AHB较CHB显著增多(P＜0.01).在9例AHB患者中,其外周血Ts183-191特异性的CTL细胞的数量为139～21 735个/106 PBMCs,用ELISPOT方法检测相对应的分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)为0～252个/106 PBMCs,AHB患者Tetramer细胞数和ELISPOT检测的IFN-γ斑点数有明显相关性(P＜0.01),而CHB患者则无此相关性.结论 AHB与CHB患者外周血中HBV特异性CTL的数量和分泌IFN-γ的差异提示CTL可能在清除病毒方面发挥着至关重要的作用,是今后慢性乙型肝炎免疫治疗的重要研究方向之一.     

PI3K p85α蛋白表达缺失联合5-FU对大肠癌细胞的促凋亡作用

探讨RNA干扰靶向抑制PI3K p85α蛋白表达联合5-FU对大肠癌LoVo细胞的促凋亡作用。方法复苏培养PI3K p85α干扰组LoVo细胞（PI3Kp85ɑ/RNAi-LoVo）和LoVo对照组细胞,Western blot鉴定干扰效果,MTT法检测5-FU对两组细胞的半数抑制浓度（IC50）,Annexin-FITC标记法检测细胞凋亡。结果 Western blot结果显示LoVo干扰组细胞PI3K p85α蛋白抑制率为59%,MTT结果显示干扰组细胞5-FU的IC50值（4.57±0.16）μmol/L明显低于对照组细胞5-FU的IC50值（8.07±0.30）μmol/L（P=0.000）,细胞凋亡实验显示,干扰组细胞对5-FU诱导凋亡的敏感性增加（P=0.000）。结论 PI3K p85α蛋白表达缺失联合5-FU可促进大肠癌LoVo细胞凋亡,为基因治疗和化学药物联合治疗大肠癌提供新的策略。     

替比夫定对乙型肝炎病毒转基因鼠孕期安全性的实验研究

目的 探讨HBV转基因鼠孕期应用抗病毒药替比夫定对降低HBV载量、HBsAg水平的有效性以及对母、胎鼠的安全性.方法 33只HBV转基因雌鼠均分为3组.交配当天至分娩当天,HBV Tg对照组每天喂0.9%氯化钠溶液,HBV Tg-L与HBV Tg-H实验组分别予替比夫定600和1200 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃.普通雌鼠11只为健康对照组,予替比夫定600 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃.交配当天、分娩当天采血.ELISA法测HBsAg,荧光定量PCR法测HBV DNA.观察4组雌鼠的妊娠生育状况及子鼠的生长发育情况,子鼠28 d时检测HBsAg、HBV DNA.数据行方差分析、t检验和χ~2检验.结果 HBV Tg对照组雌鼠用药前后血清HBsAg水平差异无统计学意义(t=0.34,P>0.05),HBV Tg-L和HBV Tg-H实验组雌鼠血清HBsAg分别为(187.39±23.18)μg/L比(160.50±27.69)μg/L,(190.48±22.43)μg/L比(161.89±21.23)μg/L(t=2.91,t=3.16;均P<0.05),用药前后血清HBV DNA水平差异无统计意义(P>0.05).HBV Tg对照组、HBV Tg-L与HBV Tg-H实验组子鼠血清HBV DNA水平分别为(11.22±1.08)、(8.38±1.80)和(8.97±1.86)lg拷贝/mL(F=4.34,P<0.05),HBsAg分别为(93.03±18.37)、(9.56±4.39)和(9.27±2.69)μg/L(F=18.11,P<0.05).各组子鼠的生长发育指标差异均无统计学意义(P>0.05).结论 孕期应用替比夫定对母鼠子鼠的安全性无影响,由于HBV转基因鼠的种类、孕期短等原因,雌鼠血清HBsAg下降明显,对HBV DNA水平影响较小.     

银杏叶提取物(EGb-761)诱导MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制

目的 基于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路研究银杏提取物(EGb-761)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制。方法 用不同浓度的EGb-761处理MDA-MB-231细胞并分组，分别对应为EGb-761低(656.25μg/ml)、中(1 093.75μg/ml)和高浓度(1 531.25μg/ml)组，对照组不含EGb-761溶剂。检测各组细胞增殖、迁移、侵袭、形态变化和凋亡情况，Western印迹检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平。结果 对照组及EGb-761低、中、高浓度组抑制率分别为(0.00±0.00)%、(27.28±5.66)%、(48.05±4.90)%、(80.30±4.00)%;迁移细胞数分别为(379.40±27.46)个、(348.80±17.08)个、(288.00±16.23)个、(224.00±11.38)个；侵袭细胞数分别为(272.60±15.37)个、(208.80±16.21)个、(127.20±11.12)个、(69.80±10.66)个；细胞凋亡率分别为(2.15±0.41)%、(23.23...