诱导条件对TNF—α ScFv在原核系统中表达量的影响

目的：探讨诱导时间对目的蛋白表达量的影响。为大量获得抗ＴＮＦ－α单链抗体提供实验依据。方法：将Ｅ６ＳｃＦｖ基因分别克隆入表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ和ｐＢＶ２２０中,构建重组质表达质粒ｐＥＴＥ６ＳｃＦｖ和ｐＢＶＥ６ＳｃＦｖ。在化学诱志和温度诱导两种条件下,于诱导后相同时间点等量取菌体,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对各时间点表达产物扫描定量。     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论：在大肠杆菌中成功地表达了抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）基因的融合蛋白     

抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源单链抗体的表达

目的研究人源抗人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）ｇｐ１２０单链抗体（ＳｃＦｖ）。方法以人工合成的ＨＩＶ－ｌｇｐ１２０Ｖ３环多肽为抗原，利用噬菌体抗体库技术，筛选含有抗－ｇｐ１２０ＳｃＦｖ基因的噬菌体，提取质粒，转化大肠杆菌ＨＢ２１５１，表达可溶性ＳｃＦｖ。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物分子量为２８ｋＤ左右，且具有ｃ－ｍｙｃ活性；ＥＬＩＳＡ和Ｄｏｔｂｌｏｔ结果表明，可溶性ＳｃＦｖ具有较好的抗原结合活性和较强的特异性；竞争性ＥＬＩＳＡ实验结果进一步证明表达产物的特异抗－ｇｐ１２０活性。结论该技术便捷有效，可大量获得人源抗ＨＩＶ抗体片段，为进一步研究抗ＨＩＶ抗体的生物活性和ＨＩＶ感染诊治打下基础     

CEA单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的尝试将ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中进行高效表达。方法以ＣＥＡ单链抗体基因为模板，设计４对引物，ＰＣＲ扩增，将４条ＤＮＡ扩增片段分别插入原核表达载体ｐＢＶ２２０中；重组质粒转染大肠杆菌ＴＧ１，４２℃热诱导外源蛋白的表达；包涵体经８ｍｏｌ／Ｌ脲溶解及谷胱甘肽系统复性；过离子交换柱进行纯化；ＥＬＩＳＡ夹心法测活性。结果得到了ＳＤ序列与起始密码ＡＴＧ分别相隔着５，６，７，８个核苷酸的重组质粒；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示转染入重组质粒的ＴＧ１菌经热诱导后有分子量约为３×１０４的外源蛋白，表达量最高达９３０ｍｇ／Ｌ培养液，约占菌体总蛋白的５０％；ＥＬＩＳＡ活性测定结果表明复性后的ＳｃＦｖ有较高的抗原结合活性。结论ＣＥＡ单链抗体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达，且经复性后有较高的抗原结合活性。     

抗CEA单链抗体与人hTNF-α融合基因的构建、表达和纯化

采用基因重组技术将已获得的抗癌胚抗原（ＣＥＡ） 单链抗体基因（ＳｃＦｖ） 与人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦ α） 基因拼接成抗ＣＥＡＳｃＦｖ ｈＴＮＦ α（免疫毒素） 融合基因, 并克隆进大肠杆菌分泌性表达载体ｐＥＴ ２２ｂ （ ＋ ） 中, 在大肠杆菌中表达了６ ×Ｈｉｓ免疫毒素融合蛋白, 其６ ×Ｈｉｓ 位于ＳｃＦｖ 的Ｎ 端, 在胞内以可溶性存在, 其表达量占菌体总蛋白的６％ , ＳＤＳ ＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 显示表达产物分子量为４３ｋＤ, 与其基因编码蛋白的理论推算值相符。经Ｎｉ２＋ ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱一步纯化的６×Ｈｉｓ 免疫毒素纯度可达９０％ 以上, 得率为０－２ｍｇ／１００ｍｌ。表达产物除了具有与ＣＥＡ 结合的活性, 也具有对Ｌ９２９细胞杀伤的功能。     

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ从两株抗ＭａｇａｉｎｉｎⅡ杂交瘤细胞株（２Ｄ１,３Ｆ８）中克隆出ＶＨ和ＶＬ基因,然后利用重组ＰＣＲ技术,将ＶＨ和ＶＬ基因通过柔性肽段（ＧＬＹ４Ｓｅｒ）３的Ｌｉｎｋｅｒ拼接成单链抗体基因（ＳｃＦｖ）,将ＳｃＦｖ克隆到表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上并将其分别在大肠杆菌Ｅ．ｃｏｋｉ ＨＢ２１５１及ＴＧ１中进行     

HBV Pre S2单链抗体基因在大肠杆菌中的克隆及初步表达

利用基因重组技术，在成功构建ＨＢＶ Ｐｒｅ Ｓ２单链抗体基因基础上，引人ＥｃｏＲ Ｉ和Ｓａｌ Ｉ酶切位点，克隆到原核高效表达质粒ｐＢＶ２２０中，筛选到２个重组克隆，经转染大肠杆菌ＤＨ５α，４２℃热敏诱导５～６小时后，超声裂解细菌产物在包被有ｐｒｅ Ｓ２抗原的阻断ＥＬＩＳＡ中，有明显的阻断亲本３Ｂ９单抗对ｐｒｅ Ｓ２抗原的亲和活性，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中，分子量２．８×１０~４处显示一条表达产物带，表达产物占菌体总蛋白的４％左右。初步表明单链抗Ｐｒｅ Ｓ２基因抗体在大肠杆菌中表达，且有较好的Ｐｒｅ Ｓ２抗原结合活性。     

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。     

抗人肝癌单链抗体的基因克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＡｂ１８中，扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ连接肽基因，将ＶＨ和ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因，并进行序列测定，结果表明，ＶＨ，ＶＬ，ｌｉｎｋｅｒ拼接正确，基因全长为７２６ｂｐ。用噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ在大肠杆菌中表达了可溶性的ＳcＦｖ融合蛋白，经流式细胞仪分析表达产物可特异地与肝癌细胞结合，而不与正常肝细胞及胃癌细胞结合。     

胶质瘤单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的 构建并高效表达抗胶持瘤单链抗体（ＳｃＦｖ）,为基因工程双功能抗体的制备及进一步用于脑肿瘤的诊治奠定基础。方法 以重、轻链可变区基因构建ＳｃＦｖ基因,并克隆入表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１,在大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３中诱导表达。以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达产物。结果 以限制性内切酶酶切及ＤＮＡ测序证实,基因构建正确,表达产物的相对分子质量（Ｍｒ）为５２０００,与理论值相符,表     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

目的：人源化抗人纤维蛋白单莲抗体,降低人抗鼠抗体反应。方法：从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ－８Ｅ５重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性最高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入ｓｃＦｖ－８Ｅ５的互补决定区。人工合成其ＤＮＡ连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５和ＶＬ－８Ｅ５,构建表达载体,转化ＪＭ１０９后用ＩＰＴＧ诱导表达,ＥＬＩＳＡ测定其抗原结合活性。结果：表达产物分子量     

抗TNF-α人-鼠嵌合抗体的构建及表达

目的：构建和表达抗ＴＮＦ－α人－鼠嵌合抗体。方法：将抗ＴＮＦ－α鼠单抗Ｚ８的轻、重链可变区基因插入到含有人ｋ链和ＩｇＧ１重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,分别构建轻、重链分开表达和共同表达的人－鼠嵌合抗体真核表达载体转染真核细胞,通过ＥＬＩＳＡ,ＲＴ－ＰＣＲ、免疫印迹检测ＴＮＦ－α的活性。用Ｌ９２９细胞检测嵌合抗体体外中和ＴＮＦ－α的活性。结果：ＥＬＩＳＡ鉴定结果表明该嵌合抗体与ＴＮＦ－α特异性     

抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化

目的人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应。方法从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性７１．８％的人源免疫球蛋白ＨＵＭＨＣＨ１０９重链（ＶＨ）序列,作为人源化改造ＶＨ－８Ｅ５的框架。人工合成人源化ＶＨ－８Ｅ５片段,用连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５,构建表达载体ｐＯＰＥ１０１－ＶＨ－８Ｅ５。转化ＪＭ１０９后用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导表达。结果经聚丙烯酰胺电泳和ＥＬＩＳＡ证明表达产物相对分子质量３０×１０３左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ＳｃＦｖ－８Ｅ５活性的４／５左右。人源化ＳｃＦｖ－８Ｅ５表达产量为转化菌总蛋白的１１．２％。结论人源化ＶＨ－８Ｅ５仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ＳｃＦｖ－８Ｅ５重链的人源化基本获得成功     

抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达

目的：构建抗内毒素（ＬＰＳ） 单链抗体基因, 并尝试其在Ｅ．ｃｏｌｉ 中的表达。方法： 采用ｌｉｎｋｅｒ Ｐｒｉｍ ｅｒ Ｍｉｘ ,按ＶＨｌｉｎｋｅｒＶＬ 的结构将鼠抗ＬＰＳ ｍ Ａｂ Ｃ３Ａ２ 的ＶＨ ,ＶＬ 基因拼接成单链抗体（ＳｃＦｖ） 基因;用ＰＥ３７３Ａ 型全自动ＤＮＡ序列分析仪测定其核苷酸序列。ＰＣＲ 扩增抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１ ;转染Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ,以ＩＰＴＧ 诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物。结果：扩增出的ＳｃＦｖ基因长７３５ｂｐ , 序列分析表明,该序列完整、正确;ＳＤＳＰＡＧＥ 显示,转染入重组质粒ｐ４ＴＣ３Ａ２Ｆｖ 的ＪＭ１０９ 菌经诱导后,有相对分子质量（ Ｍｒ） 约为５２ ０００ 的外源蛋白表达。结论：成功地构建了鼠抗ＬＰＳ ＳｃＦｖ 基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中表达了ＧＳＴＳｃＦｖ 融合蛋白。     

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关，可用于构建快速血凝诊断的工程抗体     

抗细菌核心糖脂域McAb对LPS体外诱导细胞释放TNF－α和IL－6及其mRNA表达的影响

用细胞因子活性检测，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法，在体外研究了抗细菌核心糖脂域ＭｃＡｂ（ＥＬ１、ＥＬ３和３Ｈ４）对ＬＰＳ诱导人外周血单核细胞（ｈＰＢＭＣ）释放ＴＮＦ－α和ＩＬ－６及其ｍＲＮＡ表达水平的影响。结果表明，ＥＬ１、ＥＬ３和３Ｈ４在体外有抑制ＬＰＳ诱导细胞释放ＴＮＦ－α和ＩＬ－６的作用；Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果证实，这３株ＭｃＡｂ能分别降低细胞ＴＮＦ－α和ＩＬ－６ｍＲＮＡ表达的水平；提示抗细菌核心糖脂域ＭｃＡｂ可能通过与ＬＰＳ的结合而中和ＬＰＳ，从而降低或阻碍了效应细胞炎性细胞因子ｍＲＮＡ的表达，达到降低相应细胞因子的作用。     

抗人CD4单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现的一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｖＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性。     

抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化

本研究将构建的抗人ＣＤ３单链抗体基因，克隆到融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，用ＩＰＴＧ诱导表达ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合蛋白，并以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，在Ｍｒ为５２０００左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的４０％。经初步纯化和复性后，用ＧＳＴ亲和色谱纯化，再经凝血酶水解获得抗人ＣＤ３ＳｃＦｖ，竞争结合抑制实验证明，该表达产物具有ＣＤ３亲和活性     

一种N端缺失的rhGM—CSF（7～127）在大肠杆菌中的表…

在ｈＧＭ－ＣＳＦ结构与功能研究的基础之上，通过应用ＰＣＲ介导的缺失与突变和基因重组等技术，构建了ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）的三种原核表达载体ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＧＡ，ｐＢＶ２２０／ＧＭ－ＴＡＡ和ｐＢＶ２２０／ＧＭ－３′ＵＴＲ。在三种载体内，ｈＧＭ－ＣＳＦ（７～１２７）ｃＤＮＡ的５′端块缺失６个氨基酸，３′端则分别为天然终止密码ＴＧＡ，突变终止密码ＴＡＡ和ＴＧＡ加３′ＵＴＲ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表