酮基还原酶基因dnrU敲除对柔红霉素合成的促进效应

在柔红霉素生物合成途径中,dnrU基因编码酮基还原酶,催化副产物(13S)-13-二氢柔红霉素的产生.本研究构建了dnrU基因的同框敲除质粒pYG1116,将其转入柔红霉素高产菌SIPI-HJ1001,通过同源重组双交换的方法将dnrU基因内部编码153个氨基酸的序列敲除,从而得到dnrU基因失活的突变株mYG1116.该突变株柔红霉素发酵单位比出发菌株约提高了52%.     

黑暗链霉菌中安普霉素生物合成的阻断研究

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprH～M的上、下游序列,作为同源交换臂,并以温敏复制型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49中安普霉素生物合成的重组质粒pHM106.质粒经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,并筛选得到发生同源双交换工程菌,命名为黑暗链霉菌HM106.通过PCR鉴定,证明工程菌HM106中的aprH～M被tetr替换.对工程菌HM106进行发酵产物分析,结果是其发酵效价下降明显,仅为出发菌株的40％左右.采用薄层层析(TLC)对其组分分析,其安普霉素组分消失,因此,初步判断已成功阻断安普霉素的生物合成.     

vgb在红色糖多孢菌表达及生物活性的研究

利用基因工程技术对红色糖多孢菌进行改造，提高红霉素产率。用PCR技术克隆vgb，采用电穿孔法与红色糖多孢发酵菌染色体整合，鉴定采用Western blot与Southern blotting分析。VHb活性分析采用一氧化碳（CO）差示光谱法，红霉素效价测定采用管碟法。结果克隆了含vgb的红色糖多孢菌表达质粒（pBlueV），筛选了重组红色糖多孢菌株。与原始菌株比较，重组菌株细胞发酵密度分别为1．37与2．82，红霉素效价分别为3．8与5．1，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29％。重组红色糖多孢发酵菌提高了红霉素产率，对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

基因组重排构建柔红霉素高产菌株

目的构建柔红霉素的高产菌株,提高柔红霉素发酵水平。方法用基因组重排法构建菌株,用摇瓶发酵测定效价。结果使柔红霉素发酵效价提高50%。结论对于柔红霉素发酵效价的提高,基因组重排是一个可行的方法。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.     

Co2+对红霉素重组工程菌ZL1004发酵过程的影响

在50L发酵罐上考察了重组工程菌ZL1004的组分情况,与出发菌相比,A组分由75.43%上升到87.85%,B组分由4.42%下降到0.45%,C组分由13.35%下降到1.70%,而首次关注的红霉素E和F含量,却分别升高了47.0%和48.6%.表明改造后的工程菌,随着A组分的大最提升,部分红霉素A进一步转化形成了红霉素E和F等杂质组分.通过在0h添加0.04g/LCoCl26H2O,重组菌的红霉素合成代谢流明显加强.发酵结束时,与对照相比,红霉素效价提高12.4%,其中A组分含量由7766u/mL升高至9177U/mL,杂质组分红霉素E和F的百分比分别下降了23.8%和15.6%.研究结果表明Co2+能有效提高重组工程菌ZL1004的A组分含量,同时抑制红霉素A进一步转化为红霉素E和F.     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrX基因的敲除及多柔比星产生菌的构建

柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体,由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列,将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963,转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因,得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断,对酸敏感的副产物减少,柔红霉素的产量增加了近3倍,将原野生菌改造成为多柔比星产生菌,发酵效价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当,为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。     

星形孢菌素产生菌电转化条件的优化及其高产菌株的构建

目的 提高星形孢菌素的产量。方法 本研究以星形孢菌素产生菌(Streptomyces sp. ST-07)为出发菌株，采用电转化方法和应用PCR扩增星形孢菌素生物合成的调控基因staR，成功构建含不同启动子(kasO*p和ermE*p)的加强表达staR基因的重组工程菌，分别命名为ST-D-5和ST-H-23。结果 通过对电转化条件的甘氨酸浓度、电场强度、菌丝体浓度、质粒浓度、孵育时间和孵育温度等关键参数优化，使电转化的效率从4×10⁶提高至9.6×10⁸(CFU/μg DNA)；工程菌摇瓶发酵结果表明，与星孢菌素原始菌株ST-07相比，采用kasO*p启动子构建的工程菌ST-D-5星形孢菌素的产量提高了17%，最高单位可达923 mg/L。结论 本文系统摸索了星形孢菌素产生菌的电转化条件，显著提高了电转化效率，不但为该菌株的高产遗传改造奠定了基础，而且对其他放线菌的遗传操作体系建立提供了有益借鉴。     

红霉素链霉菌抗噬菌体菌株的选育

目的筛选红霉素链霉菌抗噬菌体菌株.方法以红霉素链霉菌B-27#为出发菌株,采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理.结果筛选到一株抗噬菌体高产菌株.通过噬菌体的侵染试验和摇瓶发酵生产能力验证,其抗噬菌体能力十分稳定,红霉素发酵摇瓶效价比对照有所提高.该菌株经纯化后投入生产,有效地控制和预防了噬菌体的污染.结论采用经过紫外诱变过的孢子悬浮液与噬菌体接触的方法进行处理,可以有效的获得抗噬菌体菌株.在试验中我们还发现,在紫外灯(253.7 nm、15 W、30 cm)下照射120 s,菌株出现抗噬菌体突变的几率最高.