大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究

目的：探索大鼠神经干细胞在胚胎脑内的分布特点,并用三种不同的方法对干细胞进行克隆化培养。方法：对胚龄16天左右的大鼠胚胎脑组织做连续冠状位冰冻切片,特异的抗nestin免疫组化染色,以显示干细胞在胚胎的分布特点。我们还把胚龄16天左右的胎鼠室管膜下脑进行原代及传代培养,传代的神经干细胞用三种方法有限稀释法,饲细胞克隆培养法,软琼脂克隆培养法进行克隆培养。结果：1．神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位如：脑室、脑室下区,中脑导水管周围。神经干细胞多表现为复层上皮样排列,细胞突起呈放射状伸向脑的表层并之与保持密切联系。有的干细胞在离室管膜较远处呈簇状分布好似群状迁移的干细胞群也好似干细胞的发生中心。2．干细胞的原代及传代培养显示：神经细胞易呈聚集状生长的特点及神经细胞的迁移性的生长特点,各细胞群之间有密切的纤维联系。3．神经细胞生长的细胞密度依赖效应与细胞之间的接触在生长发育中的重要作用。结论：神经干细胞在胚胎的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位,软琼脂克隆法是一种成功的干细胞克隆方法。     

神经内镜治疗合并脑室内感染的脑积水

目的总结应用神经内镜治疗合并脑室内感染的脑积水的经验。方法采用神经内镜对54例合并脑室内感染的脑积水病人进行治疗，在结合抗生素冲洗的同时，分别行透明隔造瘘术、第三脑室底脚间池造瘘术、脉络丛凝固术及内镜引导下脑室外引流术．结果脑积水及炎症控制49例，死亡5例，随访22例无复发。结论运用神经内镜治疗合并脑室内感染的脑积水病人．能明显缩短病程，提高治愈率。     

神经导航下行26例脑积水脑室腹腔分流术

计算机辅助神经导航系统使神经外科手术定位更精确,手术并发症减少,是神经外科微侵袭手术的发展方向之一[1,2]。在各种原因和类型的脑积水治疗中,侧脑室腹腔分流术常被临床医师采用。2004年10月至2005年12月,我们应用史赛克公司(Stryker)最新红外线主动诱导计算机导航系统(Leibinger)对26例不同情况的脑积水患者进行导航下脑室腹腔分流手术,取得满意效果。现报告如下。1资料1·1一般资料:本组男17例,女9例,年龄2~65岁,平均37·4岁。术前均行CT或MR检查证实为脑积水。其中松果体区肿瘤伴脑积水伽玛刀治疗术后7例,第四脑室肿瘤术后伴脑积水…     

电刺激嗅球对脑室下区神经干细胞增殖、迁移和分化的影响

目的 探讨电刺激嗅球对脑室下区(SVZ)神经干细胞(NSC)增殖、迁移及其分化的影响.方法 取SD大鼠48只,随机分为正常对照组、假刺激组、电刺激1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d组,以5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记NSC,免疫组化法检测SVZ区NSC的增殖情况.另取大鼠18只,随机分为正常对照组、假刺激组和电刺激组,以免疫组化法观察NSC向嗅球迁移情况,荧光双标法检测NSC分化情况.结果 电刺激1 d,SVZ区BrdU阳性细胞开始增高,第7天达高峰,第3周达对照组水平.注射BrdU28 d后,电刺激组喙侧迁移流(RMS)及嗅球内的BrdU阳性细胞数较正常对照组明显增多,但两组NSC分化情况没有明显差别.结论 电刺激嗅球可促进SVZ区NSC增殖及迁移,但对其分化没有影响.

Abstract：

Objective To investigate the effects of electrical stimulation of olfactory bulb( OB) on the proliferation, migration and differentiation of neural stem cell ( NSC ) in subventricular zone. Method Forty - eight adult female Sprague - Dawley(SD) rats were randomly divided into control group, sham stimulation group and stimulation group including 6 time points(1 day,3 day,7 day, 14 day,21 day, 28 day). The rats were injected intraperitoneally with bromodeoxyuridine( BrdU) to detect the proliferation of NSC by immunohistochemistry staining. Another 18 rats were randomly divided into control group, sham stimulation group and stimulation group. Four weeks after BrdU injection, the rats were sacrificed and immunohistochemistry and immunofluorescence were used to investigate the migration and differentiation of NSC in OB. Results In SVZ, BrdU - positive cells began to increase 1 d after stimulation (17. 67 ± 1.03, P <0.01) .reached to the maximum level at 1 week(28. 50 ± 1. 87, P <0. 01) ,then decreased to normal at 3 week. Four weeks after injection of BrdU,the BrdU -positive cells significantly increased in RMS(67. 33 ±3.50, P <0.01) and OB(44.33 ±5.47, P <0.01) in stimulation group. Fluorescence double staining showed that the stimulation of OB had no effect on the differentiation of NSC into neurons or gliocytes. Conclusions Electrical stimulation of OB could promote proliferation, migration of NSC in SVZ, but it has no effect on the differentiation of NSC into neurons or gliocytes.     

脑室内肿瘤合并脑积水的神经内镜治疗

目的探讨神经内镜手术治疗脑室内肿瘤合并脑积水的方法与技巧。方法回顾性分析10例脑室内肿瘤合并脑积水的临床资料,其中肿瘤位于侧脑室5例,第三脑室4例,脑室内多发肿瘤1例。均在神经导航指引下行内镜手术,同时行第三脑室造瘘术9例,透明隔造瘘术1例。结果肿瘤全切除8例,次全切除1例,仅行活检1例。术后颅高压症状均缓解,发现不同程度发热3例,无癫间疒发作及其他严重并发症。术后脑脊液磁共振电影成像(Cine MRI)显示所有病人脑脊液循环动力学均不同程度改善。随访3～24个月,平均10.6个月,死亡1例,无肿瘤复发;复查MRI显示脑室体积轻度缩小2例,无明显变化8例。结论神经内镜手术既可切除肿瘤,又能重建脑脊液循环,可作为脑室内肿瘤合并脑积水的首选治疗方法。应根据脑室形态和肿瘤位置、大小、性质等在导航引导下选择个体化的手术入路切除肿瘤。     

大鼠胎脑皮质神经干细胞体外培养及诱导分化的实验研究

目的 从孕龄15d SD胚胎鼠脑皮质中分离并培养神经干细胞（neural stem cells。NSCs），观察其生长、增殖及分化。方法 采用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养及单细胞克隆技术，对胚胎鼠脑皮质神经干细胞进行原代、传代培养及诱导其分化。用Nestin染色鉴定神经干细胞特性，用免疫组化方法（β-Ⅲ-tubulin、GFAP染色）检测神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞状况。结果 从孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质中分离的组织，经原代及传代培养均可形成细胞克隆．切具有增殖能力。原代及传代培养细胞呈Nestin（神经上皮干细胞蛋白）表达阳性．诱导分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞的特异性抗原。结论 本实验分离、培养的孕龄15dSD胚胎鼠脑皮质细胞Nestin表达阳性．分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的神经干细胞，并具有多向分化潜能。     

神经干细胞脑室内移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的 探讨大鼠胚胎神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性。方法 取胎龄8～10d大鼠神经干细胞体外扩增．采用免疫组织化学方法检测神经干细胞及其分化后代的特异性标志巢蛋白（nestin）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。以Brdu标记神经干细胞，分别于缺血后24h和4周移植至局灶性脑缺血大鼠模型的脑室内和梗死中心，比较不同移植部位和不同移植时间神经干细胞的存活、增殖和迁移情况。结果 移植后可见移植细胞存活至少8周以上．移植部位不同不影响细胞存活。脑室内移植细胞向脑缺血区域迁移．且以缺血后24h移植组较缺血后4周移植组迁移趋向性更强。结论 大鼠胚胎神经干细胞移植至局灶性脑缺血大鼠脑室内和梗死中心均可长期存活并广泛迁移．其迁移趋化能力与缺血后移植时间有关。     

第三脑室解剖特征对非交通性脑积水婴儿第三脑室造瘘术的影响

目的总结1岁以下非交通性脑积水病儿能成功进行脑室镜第三脑室底造瘘术（ETV）的脑室解剖特征。方法回顾性分析16例1岁以下非交通性脑积水病儿的临床资料,术前均行MRI检查,结合MRI与术中脑室镜下所见的第三脑室的解剖学特征,分析其与手术效果的关系。结果MRI检查显示：可能影响实施ETV的第三脑室异常解剖特征包括巨大中间块、第三脑室底部倾斜、第三脑室前后径狭窄、桥前池狭窄、第三脑室底部厚度大于2mm;而术中脑室镜下所见影响ETV的异常解剖特征有室间孔狭窄、前联合肥大、巨大中间块、第三脑室底不透明。如果同时存在桥前池狭窄和第三脑室底部厚度大于2mm．或巨大中间块和第三脑室前后径狭窄同时出现时,将会使ETV失败的风险大大增加。结论术前MRI评估和术中脑室镜下观察第三脑室解剖学特征对成功实施ETV十分重要。     

导水管梗阻所致巨大脑室脑积水的内镜治疗

目的 探讨导水管梗阻所致巨大脑室脑积水手术治疗的指征及并发症预防.方法 神经内镜下共治疗32例巨大脑室脑积水患者,其中25例行经额入路第三脑室底造瘘术,1例行经额小脑上池囊肿造瘘术,5例行枕下入路内镜下后颅窝囊肿切除、囊腔枕大池造瘘,1例行经枕下入路导水管成形术.结果 术后随访1-4年,32例具有行走不稳、尿失禁、智商下降、精神运动发育迟缓的患者中,26例症状明显改善,6例症状未继续进展.6例术前存在高颅压症状患者术后症状改善,除1例出现硬膜下积液外,无其他严重并发症发生.结论 巨大脑室脑积水并非内镜手术治疗禁忌,凡影像检查确定为导水管梗阻所致的巨大脑室脑积水,均应积极手术治疗,改进手术方法 可以避免严重并发症的发生.     

脑室镜三脑室造瘘术治疗小儿阻塞性脑积水

目的分析本组49例病例，就手术病种和年龄的选择、手术方法及技巧做一介绍。方法全组49例，年龄1个月-18岁，平均33个月。CT、MRI及^99Tc^m-DTPA证实为脑脊液吸收功能正常的阻塞性脑积水。手术方法为经侧脑室、室间孔、三脑室置入神经内镜，于三脑室底与脚间池造一瘘孔。结果术后随访半年-5年，39例有好转；10例因无改善于术后3个月再行脑室腹腔分流手术，术后脑脊液漏3例，未有出血、感染及神经功能损伤等并发症。结论脑室镜三脑室底脚间池造瘘适用于脑脊液吸收功能正常的阻塞性脑积水。脑脊液吸收功能判断需靠同位^99Tc^m-DTPA检查。继发性脑积水治疗效果好于原发性脑积水，大龄儿童效果好于婴幼儿。     

神经干细胞移植对视网膜节细胞再生的影响

目的探讨神经干细胞（NSCs）在视神经损伤后对视网膜节细胞轴突再生的作用及其在视神经内迁移和分化。方法实验动物分对照组（PBS组），实验组（NSCs组）；成年SD大鼠在眼球后1min处切断视神经。移植NSCs或PBS至视神经断端；4周后以霍乱毒素B亚基顺行标记观察轴突再生情况，并观察NSCs在视神经内的迁移及免疫组织化学法检测移植后的细胞表达神经丝蛋白（NF）、2，3-环核苷酸磷酸二酯酶（CNP）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的情况。结果4周后视网膜节细胞再生轴突穿过视神经断端到达远端，移植的NSCs分化为星形胶质细胞并在视神经内迁移0．5～1min。免疫组织化学法检测NSCs部分呈GFAP阳性，未见NF、CNP表达。结论NSCs移植可促进视网膜节细胞轴突再生，能在视神经内迁移并在视神经周围分化为星形胶质细胞。     

大鼠胚胎脑皮层神经干细胞的分离和培养

目的探讨分离、培养、纯化大鼠胚胎神经干细胞(neuralstem cell,NSCs)的最佳条件,以获得充足的神经干细胞来源,用于中枢神经系统疾病的治疗.方法分离孕13～15 d胎鼠大脑皮层,在无血清含神经生长因子N2培养液中培养,利用有限稀释法单克隆培养和改良法连续传代纯化并扩增NSCs,免疫组织化学法对NSCs及分化细胞进行鉴定.结果可以通过体外培养获得大量神经源性干细胞,在体外经多次传代后仍具有很强的增殖能力和多向分化潜能.结论NSCs的存活和分裂依赖于神经生长因子和N2添加剂的浓度,胚胎脑组织和神经球分离方法影响NSCs的形成速度和数量.掌握NSCs的体外纯化培养和鉴定手段可为进一步研究NSCs生物学特性及神经系统损伤的治疗提供新方法.     

神经干细胞培养条件的探讨

目的探讨体外不同培养条件对小鼠神经干细胞增殖及分化的影响.方法分别用条件培养基及10 ml·L-1、 20 ml·L-1、 30 ml·L-1、 40 ml·L-1、 50 ml·L-1、 100 ml·L-1胎牛血清 条件培养基对小鼠胚胎脑组织进行培养, 用免疫组织化学方法进行鉴定.随后对不同培养条件下、不同生长时期神经干细胞生物学特性进行光镜观察.结果 10 ml·L-1、 20 ml·L-1胎牛血清 条件培养基组培养的神经干细胞比单独条件培养基组克隆球多而大; 30 ml·L-1、 40 ml·L-1、 50 ml·L-1胎牛血清 条件培养基组既有部分贴壁细胞, 也有大量的克隆球形成, 克隆球有伪足样突起, 克隆球间存在着广泛网络结构, 且单一神经干细胞核分裂旺盛; 100 ml·L-1胎牛血清 条件培养基组以贴壁细胞为主.结论在体外不同的培养条件下神经干细胞及其神经球增殖及分化不同.     

体外神经干细胞培养特性观察

目的 探讨神经干细胞(NSCs)体外分离培养和增殖的特性.方法 从新生24h内的SD大鼠脑组织分离NSCs,采用无血清悬浮培养法进行NSCs体外扩增培养.倒置相差显微镜观察细胞形态,通过绘制细胞生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力,采用免疫细胞化学法检测NSCs标志物神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达及分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表达.结果 从新生SD大鼠脑组织分离的细胞在无血清的培养基中形成悬浮的神经球.神经球具有自我更新和表达Nestin的能力,分化后的细胞能表达神经元、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性抗原.结论 从新生大鼠的脑组织中成功分离出NSCs,其具有在体外自我更新和增殖、多向分化潜能及表达Nestin的能力.     

Quiescent neural cells regain multipotent stem cell characteristics influenced by adult neural stem cells in co-culture

The source of cells participating in central nervous system (CNS) tissue repair and regeneration is poorly defined. One possible source is quiescent neural cells that can persist in CNS in the form of dormant progenitors or highly specialized cell types. Under appropriate conditions, these quiescent cells may be capable of re-entering the mitotic cell cycle and contributing to the stem cell pool. The aim of this study was to determine whether in vitro differentiated neural stem cells (NSC) can regain their multipotent-like stem cell characteristics in co-culture with NSC. To this end, we induced neural differentiation by plating NSC, derived from the periventricular subependymal zone (SEZ) of ROSA26 transgenic mice in Neurobasal A/B27 medium in the absence of bFGF. Under these conditions, NSC differentiated into neurons, glia, and oligodendrocytes. While the level of Nestin expression was downregulated, persistence of dormant progenitors could not be ruled out. However, further addition of bFGF or bFGF/EGF with conditioned medium derived from adult NSC did not induce any noticeable cell proliferation. In another experiment, differentiated neural cells were cultured with adult NSC, isolated from the hippocampus of Balb/c mice, in the presence bFGF. This resulted in proliferating colonies of ROSA26 derived cells that mimicked NSC in their morphology, growth kinetics, and expressed NSC marker proteins. The average nuclear area and DAPI fluorescence intensity of these cells were similar to that of NSC grown alone. We conclude that reactivation of quiescent neural cells can be initiated by NSC-associated short-range cues but not by cell fusion.     

Time-sensitive effects of hypoxia on differentiation of neural stem cells derived from mouse embryonic stem cells in vitro

Abstract

Objectives:

Oxygen tension is an important component of microenvironment for the differentiation of embryonic stem cells including neural lineage. However, the comprehensive influence of hypoxia on neural differentiation during embryonic neural development has not yet been examined.

Methods:

In this study, we investigated the effect of low oxygen levels (5% O₂), or hypoxia, in two stages of neural differentiation in vitro: (1) inducing mouse embryonic stem cells into neural stem cells (NSCs); and then (2) inducing NSCs into neural progenitor cells in neurospheres.

Results:

In the first stage, NSCs generation was reduced under hypoxia. Less mature morphological changes (including neural marker) of NSCs were observed, suggesting the prevention of early differentiation under hypoxic conditions. Thus undifferentiated stem cells were maintained in this stage. However, in the second stage, hypoxia induced neural differentiation in neurospheres. Nevertheless, non-neural progenitor cell formation, such as mesoderm progenitor cell lines or epithelial cell lines, was restricted by low oxygen tension.

Discussions:

Our results demonstrate that hypoxia is essential for regulating neural differentiation and show the different effects on NSC differentiation dependent on the time-course of NSC development. In the early stage of NSCs induction, hypoxia inhibits neural differentiation and maintains the undifferentiated state; in the later stage of NSCs induction, hypoxia induces neural differentiation. Our study may contribute to the development of new insights for expansion and control of neural differentiation.     

Mesenchymal stem cells expressing neural antigens instruct a neurogenic cell fate on neural stem cells

The neurogenic response to injury in the postnatal brain is limited and insufficient for restoration of function. Recent evidence suggests that transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs) into the injured brain is associated with improved functional recovery, mediated in part through amplification in the endogenous neurogenic response to injury. In the current study we investigate the interactions between bone marrow-derived MSCs and embryonic neural stem cells (NSCs) plus their differentiated progeny using an in vitro co-culture system. Two populations of MSCs were used, MSCs induced to express neural antigens (nestin+, Tuj-1+, GFAP+) and neural antigen negative MSCs. Following co-culture of induced MSCs with differentiating NSC/progenitor cells a significant increase in Tuj-1+ neurons was detected compared to co-cultures of non-induced MSCs in which an increase in astrocyte (GFAP+) differentiation was observed. The effect was mediated by soluble interactions between the two cell populations and was independent of any effect on cell death and proliferation. Induced and non-induced MSCs also promoted the survival of Tuj-1+ cell progeny in long-term cultures and both promoted axonal growth, an effect also seen in differentiating neuroblastoma cells. Therefore, MSCs provide instructive signals that are able to direct the differentiation of NSCs and promote axonal development in neuronal progeny. The data indicates that the nature of MSC derived signals is dependent not only on their microenvironment but on the developmental status of the MSCs. Pre-manipulation of MSCs prior to transplantation in vivo may be an effective means of enhancing the endogenous neurogenic response to injury.     

基于文献计量方法的神经干细胞研究现状分析

目的 分析国际神经干细胞研究领域的研究现状和研究热点.方法 通过科学引文索引数据库,应用文献计量方法,分别从文献外部特征和文献内容特征对1991-2011年的3389篇关于神经干细胞研究的文献进行统计学分析,主要分析国际神经干细胞研究的时间分布、国家分布、机构分布、基金来源,重点分析目前神经干细胞研究文献中的热点主题词.结果 神经干细胞相关研究在近10年得到了快速发展,从事该研究的主要有美国、中国、日本及欧盟国家等,基础研究内容主要集中在神经干细胞增殖、分化、基因转录、基因表达方面,神经干细胞移植研究热点集中在帕金森病、脊髓损伤、阿尔茨海默病、卒中、亨延顿病等神经系统疾病的治疗方面.结论 当前国际上关于神经干细胞的研究较为热门,也取得了令人鼓舞的进展,然而要实现神经干细胞移植治疗的临床应用,还存在诸多问题有待深入研究探索.     

神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤效果与机制对比

目的比较神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的机制及实验效果。方法选择40只Wistar成年大鼠做脊髓半横切模型,随机分为神经干细胞注射组,骨髓间充质干细胞注射组,磷酸盐缓冲液注射组和假手术组,每组10只。对比4组大鼠移植后的运动功能和脊髓损伤的修复情况。结果神经干细胞注射组各个时间点的BBB评分明显高于骨髓间充质干细胞注射组,且2组BBB评分明显高于磷酸盐缓冲液注射组,差异具有统计学意义(P0.05);神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植后的第8周,MRI显示空洞明显缩小,信号强度正常,能看到完整的脊髓,脊髓切片中能看到被标记的NSCs及BMSCs。结论脊髓损伤大鼠通过静脉注射NSCs和BMSCs均能改善运动功能,但NSCs治疗效果更为明显,应将两种方法结合起来,进一步提高治疗效果。     

挫伤脑组织对人胚神经干细胞影响的体外研究

目的 建立人胚胎来源的神经干细胞体外培养方法，初步研究挫伤脑组织提取液(TBITE)对人胚神经干细胞(HNSCs)存活、增殖能力和分化的影响。方法 10周龄左右的胎儿大脑皮层细胞体外培养，神经干细胞增殖2～3代后，剔除生长因子，分别加入不同浓度的脑外伤病人的挫伤脑组织提取液，培养2～3周后，免疫细胞化学方法鉴定细胞分化后的类型。用Laemrnli凝胶电泳法分析培养液上清。结果成功获得以神经球形式生长的人胚神经干细胞，Nestin表达阳性；与空白对照相比，TBITE组中的神经干细胞有明显的增殖，并分化为神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着TBITE含量的增加，星形胶质细胞的比例增加。结论 脑外伤的局部微环境可促进神经干细胞增殖和分化。