has-miR-203真核表达载体的构建及对K562细胞增殖与凋亡的影响

目的构建hsa-miR-203(人微小非编码RNA-203)的真核表达载体,观察其对人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)增殖和凋亡的作用。方法构建hsa-miR-203靶向基因的真核表达载体PmiR-203,用脂质体转染法将PmiR-203转染K562细胞;可溶性噻唑盐-8(WST-8)法检测转染后的K562细胞增殖的情况,流式细胞术检测转染后K562细胞的早期凋亡率,实时荧光定量RT-PCR检测bcr/abl mRNA的表达水平,比色法测定caspase-3、caspase-9的活性。结果本法成功构建了重组真核表达载体PmiR-203,流式细胞术结果表明,K562细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达率52.6%。PmiR-203转染K562细胞48 h后,能明显抑制K562细胞的增殖,并促进细胞的早期凋亡。实时荧光定量RT-PCR结果表明,不同浓度的PmiR-203能显著下调bcr/ablmRNA的表达水平,转染后K562细胞的caspase-3、caspase-9的活性明显增强。结论成功构建了hsa-miR-203的真核表达载体PmiR-203,后者主要通过下调bcr/abl融合基因的表达抑制K562细胞的增殖,并通过活化caspase-3、caspase-9促进K562细胞的早期凋亡。     

逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。     

IGFBP7基因慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达

本研究构建胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因的慢病毒载体,为研究该基因在白血病中的作用提供基础。采用限制性内切酶酶切获得目的基因,基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7,用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,并采用多种方法鉴定。结果表明,所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致,慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamHⅠ酶切鉴定片段大小正确,荧光显微镜及流式细胞术检测到绿色荧光蛋白在293T及K562细胞中表达,RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7 mRNA和蛋白在K562细胞表达。结论:成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体,为研究IGFBP7基因在K562细胞中的作用奠定了基础。     

人表皮生长因子真核表达载体的鉴定

目的：鉴定人表皮生长因子的真核表达载体。方法：重组体进行限制性酶切及PCR可见目的片段。结果：pCDDA3.1—hEGF真核表达载体已成功构建。结论：已成功构建hEGF真核表达裁体，为进一步研究hEGF的功能奠定了基础。     

双自杀基因慢病毒转移载体系统的构建及其对K562细胞的杀伤作用

为了探讨双自杀基因慢病毒转移载体系统对K562细胞的杀伤作用,采用分子生物学方法构建了含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.coli CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的双自杀基因慢病毒转移载体,将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒(目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒)用脂质体分为2组(实验组、对照组)共转染入病毒包装细胞293T,在荧光显微镜下观察转染效果,在透射电镜下观察上清中的病毒颗粒.大量收集病毒上清,浓缩后感染K562细胞,荧光显微镜下观察感染效果,RT-PCR鉴定目的基因在K562细胞中的整合转录.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和(或)无环鸟苷(GCV)后,用MTT法测定体外杀伤效应,扫描电镜下观察使用前体药物后K562细胞的变化.结果表明成功构建了双自杀基因慢病毒转移载体,脂质体法可有效将上述慢病毒表达质粒转入293T细胞.荧光显微镜下观察到对照组大量绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein,GFP)表达.透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒.荧光显微镜下观察到此基因转移载体系统对293T细胞及K562细胞的感染率均很高,单独使用GCV或5-FC对转染自杀基因的K562细胞的生长抑制率(growth inhibition ration,GIR)分别为48.73%、50.16%,与未转染K562细胞比较明显升高,有显著性差异(P＜0.01),联合使用5-FC和GCV时K562细胞的GIR为87.69%,比单独使用5-FC或GCV时明显升高,有显著性差异(P＜0.01).结论双自杀基因慢病毒基因转移载体系统可将双自杀基因高效转移至K562细胞,是一种有效的基因转移载体系统.     

乙肝反义全基因真核载体的构建及在SMMC—7721细胞内的表达

目的 研究HBV反义全基因真核表达载体在抗HBV基因治疗的可能性,方法 采用基因重组技术,将HBV全基因片段反向插入真核细胞表达载体pBK-CMV克隆位点中,通过FuGENE^TM6转染试剂,将重组体转染人肝癌细胞系SMMC-7721细胞,结果 经RT-PCR表明,重组体导入的人肝癌细胞内有HBV反义RNA转录表达,且重组体导入对细胞生长无明显影响。结论 HBV全基因真核细胞表达载体在SMMC-7721细胞中能转录表达反义RNA,因而有可能利用反义技术和转基因方法进行HBV全基因反义RNA抗HBV研究。     

靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景:Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色.虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题.目的:构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成.材料:pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5 α、293细胞为自备.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆AktlDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind m的酶切位点,构建Akt1真核表达载体Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞.主要观察指标:蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达.结果:经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符.将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达.结论:构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达.     

D-氨基酸氧化酶基因在K562细胞中的表达及其介导的细胞毒性作用的研究

目的探讨逆转录病毒介导的红色酵母D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因在K562细胞中的表达及其功能.方法将DAAO cDNA克隆至逆转录病毒载体pLSN中,构建了载体pLDAAOSN,经ΦNXA细胞包装后,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,以重组逆转录病毒感染K562白血病细胞,G418筛选出抗性克隆,命名为KDAAO.PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达,并以不同浓度的D-丙氨酸(D-Ala)处理KDAAO细胞.结果重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因.包装细胞产生了高滴度病毒(5.2×106 cfu/ml).DAAO基因已整合至KDAAO细胞基因组中,并在mRNA水平表达.D-Ala能明显杀伤KDAAO细胞.结论 DAAO/D-Ala自杀基因系统可以进一步用于肿瘤的基因治疗研究.     

NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响

目的NOR1基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）的构建并了解其对肝癌细胞系HepG2生长的影响。方法将NOR；cDNA亚克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达载体上，并把重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR，经脂质体转染至HepG2细胞中，运用MTT法、台盼蓝排斥等试验、流式细胞仪等分析NOR，基因对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响。结果成功构建了NOR。基因真核表达体pcDNA3．1（＋）／NORl，经pcDNA3．1（＋）／NOR1转染后的HepG2细胞生长速度明显抑制（P〈0．05），且细胞从G0／G1期进入S期明显延缓。结论重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR1能在HepG2细胞内表达，且能影响HepG2细胞的生长。     

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2（IL-2）分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。     

NSE启动子调控的pNSE-IRES2-EGFP-p27双顺反子真核表达载体的构建及表达分析

目的:构建并鉴定带NSE启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体pNSE-IRES2-EGFP-p27,转染原代培养的神经元,观察其表达。方法:通过质粒抽提,电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的神经元特异性表达载体pNSE-IRES2-EGFP-p27;转染体外培养的神经元观察EG-FP的表达及通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果:经酶切和测序鉴定,成功构建真核表达载体pNSE-IRES2-EGFP-p27;转染pNSE-IRES2-EGFP-p27后神经元中可见EGFP的表达,且EGFP阳性细胞中p27表达水平明显增高。结论:NSE启动子能启动目的基因p27和EGFP在神经元的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子NSE的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究神经元细胞周期与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。     

转染真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27对星形胶质细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染体外培养星形胶质细胞后对其增殖的影响。方法:利用脂质体将质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染入纯化培养的星形胶质细胞,通过免疫荧光化学标记观察转染质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27后星形胶质细胞内外源基因EGFP、p27的表达情况,并观察其对星形胶质细胞Ki67表达的影响。结果:脂质体介导质粒pGFAP-IRES2-EGFP-p27转染后24 h即开始有EGFP的表达,48-72 h EGFP表达达高峰;通过免疫荧光标记发现,表达EGFP的细胞同时有p27表达水平明显增高;和EGFP阴性细胞相比,EGFP阳性细胞中Ki67的阳性率明显下调(P<0.01)。结论:GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达;连于p27的下游EGFP可作为报告基因,通过观察EGFP的表达可了解外源性p27的表达情况;导入外源性p27能有效抑制星形胶质细胞的增殖。     

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3．1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS一7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论：采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FIX功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。     

携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。