ARHI基因转染PANC1细胞后对细胞凋亡和自噬相关基因表达谱的影响

目的 观察ARHI基因转染PANC1细胞后对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达谱的影响.方法 采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒pIRES2-EGFP-ARHI、空质粒pIRES2-EGFP转染胰腺癌PANC1细胞.采用基因芯片RT2ProfilerTM PCR Array行实时定量PCR,分析转染细胞的基因表达谱,包括84个与凋亡和自噬相关基因.结果 ARHI基因转染组PANC1细胞有9个基因mRNA表达下调,38个基因mRNA表达上调,37个基因mRNA表达变化无意义.在与凋亡相关的基因中有8个促凋亡基因表达显著上调（＞6倍）,主要为TNFR/TRFSR家族基因（TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9）、CIDE家族基因（DFFA）、CASP家族基因（CASP10、CASP8）和死亡结构域家族基因（DAPK1）,其中以DAPK1上调尤为明显,达42.83倍;抗凋亡基因中3个基因（CD27、BCL2L10、BIRC4）表达显著上调（＞6倍）,3个基因（BCL2、BAD、BAG4）表达轻度上调（＞2倍）,1个基因（BCL2L1）表达轻度下调（＜-2倍）.在与自噬相关的基因中3个促自噬基因（TNFRSF10B、DAPK1、CASP10）表达显著上调（＞6倍）,4个基因（TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53 BP2）表达轻度上调（＞2倍）;3个抑制自噬基因（BCL2、CASP8、FAS）表达轻度上调（＞2倍）,1个基因（MCL1）表达轻度下调（＜-2倍）.结论 ARHI基因显著上调细胞凋亡及自噬重要调控基因Caspase-8和DAPK1.     

NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭作用的影响及机制

目的探讨NF-κB基因对胰腺癌细胞侵袭的影响及机制。方法应用NF-κB基因小于扰RNA（siRNA）转染处理人胰腺癌PANC-1细胞,采用Westernblot方法检测NF-KB蛋白水平,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞侵袭能力。收集转染48h的癌细胞,采用包含有96个转移相关基因的芯片检测基因表达情况;根据基因芯片结果,随机抽取3个表达明湿变化的基因采用荧光实时定量PCR（RT—PCR）验证基因芯片结果。结果转染组癌细胞NF-κB蛋白水平下调（P〈0．05）,且与时间和浓度相关。与对照组比较,转染组细胞的穿膜细胞数减少（P〈0．05）,且呈浓度依赖关系。基因芯片检测发现,96个基因中有11个基因表达出现明显变化,其中9个基因明显下调,包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-7和血管内皮生长因子（VEGF）,有2个基因出现明显上调。采用荧光RT—PCR方法检测MMP-2、MMP-7、VEGF基因表达,结果也发现这3个基因表达下调,且下调幅度与基因芯片结果一致。结论NF-κB基因siRNA转染可明昆抑制胰腺癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与下调MMP-2、MMP-7和VEGF有关。     

Smad4基因沉默对胰腺上皮内瘤变细胞基因表达谱影响的初步研究

抑癌基因Smad4失活可使由Kras基因突变启动的胰腺上皮内瘤变（PanIN）细胞发生恶性转化,但其具体机制尚未阐明。目的：探讨Smad4基因沉默的PanIN细胞（PanIN—S细胞）基因表达谱的变化,分析Smad4基因沉默致PanIN细胞增殖和恶性转化的可能分子机制。方法：通过RNA干扰沉默PanIN细胞的内源性Smad4基因表达以构建PanIN—S细胞．小鼠全基因表达谱芯片筛查PanIN细胞与PanIN-S细胞的基因表达谱差异．实时荧光定量RT—PCR验证基因芯片筛选出的细胞周期相关差异表达基因。结果：基因芯片共筛选出237个差异表达基因,其中148个基因在PanIN—S细胞中表达上调,89个表达下调。差异表达基因主要涉及细胞周期、增殖、凋亡、黏附、转录活性等。实时荧光定量RT．PER验证示细胞周期相关基因p27、p19、细胞周期蛋白（cyclin）D1表达在PanIN细胞与PanIN—S细胞间存在显著差异,与基因芯片筛选结果一致。结论：PanIN-S细胞p27、p19和cyclinD1基因表达发生明显改变．可能参与了PanIN—S细胞的增殖和恶性转化。     

拓普替康耐药卵巢癌细胞基因的表达变化及意义

目的 探讨人卵巢癌获得性拓普替康（TPT）耐药的相关基因。方法 采用大剂量间歇诱导法，用拓普替康（TPT）反复冲击诱导培养人卵巢癌SKOV3细胞株，建成SKOV3／TPT耐药株。用Affymetrix人类基因组U133A基因表达谱芯片，比较SKOV3／TPT及SKOV3细胞基因表达的差异。选择高表达的基因进行RT—PCR验证。结果 基因芯片检测发现，二者有283种基因表达有显著性差异。有7个差异表达基因可能参与了SKOV3／TPT细胞的耐药机制，其中上调最明显的基因为MRP3，其次为MRP7、钠离子通道蛋白及固醇异构酶基因；明显下调的基因有MRP4、假设蛋白和免疫球蛋白基因。RT—PCR检测MRP3mRNA在耐药细胞中呈高表达，与基因芯片结果一致。结论 MRP3、MRP4、MRP7、钠离子通道蛋白、固醇异构酶、假设蛋白和免疫球蛋白基因为人卵巢癌获得性TPT耐药相关基因。     

丙型肝炎病毒不同功能区抗体与病毒核糖核酸的相关性

目的 探讨慢性丙型肝炎患者体内不同功能区抗体的免疫应答及与HCV RNA浓度的关系。方法 克隆表达丙型肝炎病毒不同功能区优势表位抗原蛋白(HCV—C、NS3、NS4、NS5和HVR1)，建立单片段ELISA法检测抗HCV抗体，并以定量HCV RT—PCR法检测患者血清中HCV RNA浓度。结果 慢性丙型肝炎患者体内HCV不同功能区抗体检出有较大的差异，HCV—C、HVR1检出最高，其次为NS3、NS4和NS5。结论 HCV—C、NS3、NS4、和HVR1抗体滴度与HCV RNA浓度均有较好的相关性。     

丙型肝炎病毒NS4B对p53表达及细胞凋亡的影响

目的研究丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）对肝细胞内抑癌基因野生型p53表达及细胞凋亡的影响。方法通过脂质体介导法,将空白载体PCXN2、HCVNS4B重组质粒PCXN2-NS4B、野生型p53表达质粒分别或共引入Chang肝细胞内,并以C418筛选作稳定传代,lit—PCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内,原位杂交法分别检测载体组、NS4B组、p53组、NS4B—p53组的p53mRNA表达情况;TUNEL法流式细胞术观察四组的肝细胞凋亡率。结果与载体组比较,NS4B组未促进或抑制p53mRNA表达（P〉0．05）;与p53组比较,NS4B—p53组的正常肝细胞p53mRNA降低（P〈0．01）;载体组、NS4B组、p53组、NS4B—053组的细胞凋亡率分别为（17．02±1．24）％、（11．94±2．24）％、（25．84±3．49）％、（18．34±1．55）％。结论NS4B可抑制p53基因表达及肝细胞凋亡,可能通过抑制p53表达抑制细胞凋亡。     

用cDNA微矩阵研究肝纤维化基因表达的变化

目的：筛选在肝纤维化过程中发生异常表达的基因。方法：建立四氯化碳诱导肝纤维化大鼠模型：选取正常和造模大鼠肝脏各1只进行cDNA微矩阵（microarray)研究；从cDNA微矩阵研究结果中选取一个在造模大鼠肝脏中表达明显异常的基因（smurf 2)，用半定量RT－PCR检测此基因在不同实验阶段（第1、2、4、8）两组大鼠中的表达变化。结果：通过cDNA微矩阵发现在肝纤维化过程中，smurf 2、PTAFR、CYP2D6、FGG等许多和炎症、代谢有关的基因表达均上调。通过半定量RT－PCR研究发现经四氯化碳处理等1周时smurf 2基因在造模大鼠肝脏中表达与正常大鼠表达无明显变化，第2周时表达下调，第4周时表达明显上调，第8周时该基因表达又趋于下降。结论：smurf 2基因转录水平的变化，影响smad-TGFβ信号传导的调控，可能参与了四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的形成过程。     

基因表达谱芯片筛选NS5ATP2剪切体NS5ATP2-512转染细胞差异表达基因

目的应用基因芯片技术检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活基因NS5ATP2剪切体512的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明NS5ATP2剪切体512蛋白可能的分子生物学功能。方法设计并合成NS5ATP2基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS5ATP2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的NS5ATP2编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,在此过程中发现其剪切体NS5ATP2512并构建真核表达载体pcDNA3.1(-)NS5ATP2512。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有14个基因表达水平显著上调,15个基因表达水平显著下调。结论应用基因表达谱芯片技术成功筛选了NS5ATP2剪切体NS5ATP2512转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS5ATP2512蛋白可能的生物学功能提供依据。     

HIV-1感染对T淋巴细胞p16INK4A基因甲基化及其表达的影响

目的；p16^INK4A基因在与AIDS相关的疾病中的表达缺陷，DNA甲基化可使基因转录下调。本研究观察人类免疫缺陷病毒I型（HIV－1）感染对T淋巴细胞的p16^INK4A基因的表达影响及其途径。方法：建立感染有野生型和突变体HIV－1病毒的T淋巴细胞Hut78细胞系，以RT－PCR、定量PCR和Western blotting检测细胞感染后不同时间的DNA甲基化酶（DNMT）1、3a和3b的mRNA（提高40％以上）和蛋白质水平；并由甲基化特异PCR（MSP）了解p16^INK4A基因甲基化改变，及通过RT－PCR研究该基因的mRNA表达情况。结果：无论野生型抑或突变体HIV－1感染，都能使Hut78细胞中DNMT1表达增强，DNMT3a和DNMT3b无明显变化。HIV－1感染可引起p16^INK4A基因启动子区甲基化水平提高和基因转录水平下调。结论；HIV－1感染可使p16^INK4A甲基化水平升高和表达降低，且与该病毒有无复制无关。     

HCV阳性无偿献血者与急慢性丙肝患者单片段HCV抗体、HCV-RNA检测结果分析

采用EIA法和RT—PCR技术，对ALT正常、HCV阳性无偿献血者与急慢性丙肝感染患者进行单片段HCV抗体、HCV—RNA检测。结果显示，C、NS3抗体出现较早，检出率、反应性较强，对丙肝有诊断价值。慢性丙肝NS4、NS5抗体检出率较高，RT—PCR检出率低于抗体检测，可发现早期感染者。抗-E1和抗-E2抗体阳性率明显低于其他抗体，提示膜区具有保护性。