牛脱细胞肌腱基质的制备方法研究

目的:探究牛肌腱组织脱细胞的方法,为组织工程法修复肌腱所需生物材料的制备提供理论和实验基础。方法:牛的肌腱作实验材料,被组织粉碎机粉碎后,依次放入不同浓度的胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浸泡处理后,所得基质用过氧乙酸-乙醇溶液中灭菌消毒处理,然后依次用蒸馏水和PBS缓冲液洗涤、过滤。最后冷冻、干燥、保存。冰冻切片进行苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况。微量DNA提取试剂盒提取脱细胞后跟腱基质DNA,检测DNA的残留量。结果:大体观察可见,各实验组跟腱组织经脱细胞处理后,均呈乳白色匀浆状。苏木素-伊红染色结果显示,跟腱组织脱细胞处理后细胞核均大量减少,细胞核残留极少,每高倍视野中细胞核残留不大于5。DNA含量结果显示,当牛跟腱组织依次经过0.5%胰蛋白酶溶液处理2h、1%的Triton X-100溶液处理2h、0.5%的SDS溶液处理1h后,得到的肌腱脱细胞基质DNA含量最少,为0.03μg/mg。结论:依次用胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浓度分别为0.5%、1%、0.5%、处理时间分别为2h、2h、1h时,对牛肌腱组织的脱细胞效果最佳。     

脱细胞血管基质的制备方法研究

目的:通过不同脱细胞方法制备脱细胞血管基质材料,比较筛选出较为理想的血管脱细胞方法,为临床血管修复提供良好的组织工程生物材料。方法:1采用不同浓度的胰蛋白酶、Triton X-100、SDS组合,对牛血管进行脱细胞处理,制备脱细胞牛血管基质。2苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况,以比较脱细胞效果。3利用微量样品基因组DNA提取试剂盒提取脱细胞血管基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测DNA含量。结果:大体观察:各组血管经过不同脱细胞方法处理后,所得脱细胞血管基质呈乳白色。苏木素-伊红染色观察:光镜下观察,可见各组均有不同程度的细胞核残留,其中1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS组和0.1%胰蛋白酶Triton X-100+0.5%SDS所制备的脱细胞血管基质细胞核残余最少,每高倍视野中细胞核残留不大于3。DNA提取检测:所提取DNA的含量显示,0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的脱细胞效果较好,DNA残留量分别为0.22μg/mg和0.231μg/mg。结论:应用0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的方法来制备脱细胞基质的效果较好。     

低免疫原性脱细胞神经基质的制备及其理化性能

目的：制备低免疫原性异种脱细胞神经基质并评估其理化性能。方法：以α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪坐骨神经为实验原料对基因敲除猪坐骨神经进行脱细胞处理制备低免疫原性异种脱细胞神经基质，通过HE、DAPI染色及DNA残留量检测评价神经组织的脱细胞效果；I型胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白免疫组织化学及天狼猩红染色评价脱细胞神经细胞外基质组分保留情况；α-1，3-半乳糖基（a-gal）免疫荧光检测异种抗原a-gal的残留；扫描电镜（SEM）分析脱细胞神经三维组织结构及孔隙率。结果：组织染色显示脱细胞神经基质内膜、外膜、束膜中的细胞均去除干净，DNA定量结果显示DNA含量下降了95%。天狼猩红染色及免疫组织化学结果显示脱细胞神经组织较好地保留了胶原纤维与细胞外基质主要蛋白。SEM结果显示脱细胞神经较好地保留了其三维组织结构，细胞毒性检测表明脱细胞神经基质无细胞毒性。结论：本研究自主设计的四联脱细胞方案能彻底去除神经组织中的细胞成分与异种抗原，并且较完整地保留了神经组织结构，与天然神经具有高度相似性。     

猪主动脉脱细胞血管基质制备

目的研究脱细胞血管基质的制备方法。方法采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理猪胸主动脉来制备脱细胞血管基质，标本作苏木素-伊红染色，大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察。结果经该法处理的血管细胞全部脱除，胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好。结论酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备脱细胞血管基质的较好方法。     

冰冻切片苏木紫-伊红快速染色法探讨

探讨冰冻切片苏木紫-伊红快速染色法,为临床及时提供诊断信息。苏木紫-伊红快速染色方法制作出的标本,细胞形态和结构清晰,细胞核、细胞质显色良好,染色过程快,仅5 min后即可镜检,可及时为临床提供送检标本性质。     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

脱细胞基质面神经修复材料的制备

目的 制备具有天然神经组织结构的支架,构建组织工程化面神经用于修复面神经损伤。方法 取家兔面神经,改良化学萃取法制备脱细胞神经基质,HE染色形态学观察去细胞及脱髓鞘情况,荧光分光光度计测定支架内细胞经Quant-iT PicoGreen工作液染色后的DNA含量。MTT法检测细胞在支架上的相对生长率从而检测支架的细胞毒性。结果 支架移植体呈圆柱形,弹性与正常神经基本一致,组织观察显示细胞结构未见残余完整细胞及细胞碎片残留,未见神经髓鞘及轴突结构,细胞外基质形成纵向排列结构,结构之间可见空隙。兔脱细胞面神经基质支架内残留的DNA含量较正常兔面神经明显下降(P<0.01)。神经基质供体无细胞毒性。结论 改良化学萃取法可有效去除面神经细胞,天然结构保存完好,细胞毒性低,可作为组织工程化面神经的支架。     

浅谈HE染色切片着色浅的原因及改进方法

HE染色法是组织学与病理学常用的切片染色方法,HE染色切片标本是学生观察最多的一种切片标本。伊红（Eosin）,又名曙红,呈红色粉末状,易溶于水和酒精,市面上有伊红Y和伊红B两种,常用者为伊红Y。一般采用0．5％～1％的水溶液作为染色液;也可用70％～95％的酒精配成0．1％～1％的酒精伊红溶液。伊红溶液是一种酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。苏木精（Hematoxylin）,亦名苏木紫或苏木素,用于细胞核的染色。笔者最近在制作一些HE染色科研及教学切片中发现（染液和以前配方相同）,HE染色不易着色或着色不均,针对此现象,浅谈几点原因及解决方法。     

冰冻切片制作中时间和温度的研究

目的 探讨控制组织冷冻温度及时间,以提高诊断准确性.方法 择取新鲜活体组织,取材后直接冻结,经恒温式冰冻切片机切片,冰冻固定液固定,苏木素伊红快速染色.结果 质量较好,染色鲜艳,镜下组织结构细胞形态清晰,细胞核浆对比分明.结论 组织冷冻时的温度和时间的控制是制片的关键,快速特殊染色可辅助提高病理诊断的准确性.     

快速冰冻切片染色的一种新方法

缩短冰冻切片及染色时间 ,提高冰冻切片质量 ,是病理医师进行准确诊断的重要环节 ,也是临床医师及时决定治疗方案的关键所在。为此 ,我们在工作实践中逐步摸索出一种更快速、更简便的冰冻切片及染色方法。这种方法是以 - 2 5℃直接冰冻切片标本 ,用苏木素、伊红的混合液染片 ,使整个冰冻制片过程仅在 1～2分钟内完成 ,染色效果鲜艳且稳定。1　材料及方法1.1　材料　进口或国产冰冻切片机。染液配制 :1固定液 :5 5 %乙醇 85 ml,4 0 %甲醛 10 ml,冰醋酸 10 m l。2苏木精∶伊红混合染液。复制伊红一份 ,Herry苏木精3～ 8份混合即可使用。1.2　…     

石蜡切片HE染色着色不良的原因及矫正方法

HE染色法是组织学与病理学常用的切片染色方法,在各级医院及组织学实验室中普遍使用,其操作简便,结果稳定,不易褪色。伊红(eosin),又名曙红,呈红色粉末状,易溶于水和酒精,市面上有伊红Y和伊红B两种,常用者为伊红Y。一般采用0·5%~1%的水溶液作为染色液;也可用70%~95%的酒精配成0·1%~1%的酒精伊红溶液。伊红溶液是一种酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。苏木精(hematoxylin),亦名苏木紫或苏木素,用于细胞核的染色。我们虽然每天都在做大量的HE染色以满足诊断需要,但是在常规石蜡切片HE染色的过程中常会出现一些弊病,使…     

软骨微粒脱细胞基质的制备及其特性

目的　制备以家猪关节软骨微粒细胞外基质即微粒脱细胞基质 (CartilageMicroparticleAcellularTis sueMatrix ,CMACTM) ,为软骨组织工程提供新型的支架材料。方法　利用氯化钾、去离子水、胰蛋白酶等试剂制备直径为 0 1 0 0～ 0 1 5 4mm的软骨微粒脱细胞基质并寻找胰蛋白酶的最佳浓度及时间。取家猪的新鲜膝、肘关节软骨 6 0 0g ,随机分为 5组 ,每组 8例 ,用不同浓度的胰蛋白酶作用 2～ 36h不等。标本行苏木素 -伊红、胶原染色 ,光镜及扫描电镜观察。结果　微粒软骨脱细胞基质微载体无抗原性成分存在 ,主要含有胶原 ,氨基葡聚糖等混合细胞外基质成分。微粒呈不规则形 ,表面粗糙。胰蛋白酶的最佳含量为 2 5g/L ,最适作用时间为 (1 8 3± 1 6 )h。结论　软骨微粒脱细胞基质含有天然细胞外基质成分 ,是一种体外培养软骨细胞的良好支架。     

苏木素-伊红染色切片褪色的解决办法

苏木素-伊红(hematoxylineosin staining,HE)染色法是石蜡切片技术里常用的染色法之一.苏木素染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料 ,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色.但在教学中由于种种原因,切片长久使用, 观察到渐渐褪色现象,直接影响到教学和科研.通常使用酸性高锰酸钾氧化、草酸氧化漂白还原法,容易破坏组织结构,不能适应实际需要.为了解决这一问题,在实际工作中经过摸索实践,以下步骤可以恢复原来的切片.     

甲状腺冰冻切片制作方法的探讨

目的探讨甲状腺冰冻切片制作方法,提高冰冻切片质量。方法取材后直接冷冻,切片后立即放入甲醇醋酸混合固定液固定,苏木素伊红快速染色。结果切片质量较好,染色鲜艳,镜下组织结构清晰完整,核浆红蓝对比鲜明、细胞无明显膨胀、极少有冰晶形成,优片率达98%以上。结论冰冻切片机的适宜温度、冰冻时间、固定液的选择、切片技巧、染色等是制作高质量冰冻切片的关键因素。     

兔主动脉脱细胞血管基质的制备

目的 研究脱细胞血管基质的制备方法.方法 采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质, 标本经苏木精-伊红染色光镜观察,20 g/L戊二醛固定做扫描电镜、透射电镜观察.结果 光镜下血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,细胞已全部除去;扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径(100～150)μm ×(10～20)μm;透射电镜观察示胶原和弹性纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂.结论 胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔主动脉,可使血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好.     

HE染色的组织切片褪色的原因分析

组织切片的染色是使无色的组织结构呈现颜色 ,增加对比度 ,便于镜下分辨。最常用的染色方法是苏木精 (Ｈｅｍａ ｔｏｘｙｌｉｎ)和伊红 (Ｅｏｓｉｎ)染色法 ,简称ＨＥ染色法。通常应用于各种固定 ,包埋方法所制作的组织石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片、深片、印片等。在病理诊断、病理和组织学教学及科研中均有重要的价值。组织经ＨＥ染色后 ,细胞核和胞质内的嗜碱性物质被苏木精染成蓝紫色 ,细胞质基质和间质内的胶原纤维被伊红染成深浅不同的粉红色。具有色彩鲜艳、对比明显的特点。但在操作中 ,由于种种原因而至切片在保管过程中褪色 ,…     

适用于犬输尿管脱细胞基质制备的灌注系统

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制 备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3 个不同的灌注组,单纯SDS 组、单纯TritonX-100 组以及联合组 （TritonX-100+SDS）。利用HE染色,DAPI染色,DNA定量,琼脂糖凝胶电泳评价输尿管脱细胞基质中细胞核的残留情况。采 用Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定、GAG含量测定、扫描电镜和毒性检测等手段评价制备输尿管脱细胞基质 的三维结构和生物活性成分。结果HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留, DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留 了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结 构。毒性测定证实联合组制备的输尿管脱细胞基质无毒性。结论本研究灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一 套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可用于输尿管组织工程再造。     

脱细胞鼠肾生物支架的制备及其体内相容性

目的：制备一种抗原封闭完全,蛋白成分保留完好,生物性能较好的鼠肾脱细胞基质支架,并对其体内生物相容性进行分析。方法：取健康SD大鼠,采用腹主动脉在体灌注去污剂的方法制备全肾脱细胞基质支架,对处理后的支架材料进行形态结构观察,主要成分分析;将其支架进行皮下包埋检测体内细胞相容性。结果：经脱细胞处理后,肾支架形态上具有三维立体空间结构,肉眼可见其内血管脉络;DNA残留量不及正常组3%;HE、透射电镜（TEM）、PAS等观察细胞成分已完全去除,细胞外基质网络结构保留完整;免疫荧光显示细胞外基质成分Ⅳ型胶原（collagen Ⅳ）、层黏连蛋白（laminin）及纤维黏连蛋白（fibronectin） 均呈强阳性表达,未见明显细胞核成分残留;皮下植入结果显示,初期炎症反应明显,随着时间推移,炎症减轻,支架内逐渐有血管长入,基质逐渐降解。结论：经去污剂灌注处理的脱细胞肾基质,可有效清除肾内所有细胞成分,较好地保留细胞外基质支架且形态完好,具有良好的组织相容性。     

不同脱细胞方法制备的AECM成分分析及比较

目的:比较不同脱细胞方法制备的大鼠坐骨神经细胞外基质材料(acellular extracellular matrix,AECM)的组分,为解决临床周围神经损伤修复移植体的来源提供实验依据。方法:分别采用优化的化学萃取脱细胞方法和低渗-酶消化法制备大鼠坐骨神经AECM,通过HE染色、变色酸2R-亮绿染色、免疫组织化学染色和SDS-PAGE对AECM的结构成分进行检测和比较。结果:不同方法制备的大鼠坐骨神经AECM在基底膜管完整性、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)活性、去细胞程度和脱髓鞘程度方面无显著性差异。结论:应用优化的化学萃取脱细胞方法和低渗-酶消化法制备的AECM,均具有良好的仿生性,是修复周围神经缺损的适宜移植物。     

抗酸-免疫组化双重染色在结核病组织病理学研究中的应用

目的:研究抗酸和免疫组织化学双重染色法在同一张切片上清晰显示结核分支杆菌与巨噬细胞的分布状态.方法:组织切片常规脱蜡、入水,其染色分别按抗酸-免疫组化-苏木素;免疫组化-抗酸-苏木素和免疫组化-苏木素-抗酸顺序进行.结果:组织切片按免疫组化-抗酸-苏木素顺序染色,背景清晰,反差明显,较另两种染色顺序显色效果好.结论:组织切片按首先免疫组织化学染色,在抗酸染色,最后苏木素染色的步骤染色效果最好.能在同一切片中清晰显示结核分枝杆菌与巨噬细胞的分布情况.