马钱子碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231作用的实验研究

目的本研究旨在观察马钱子碱（Brucine）对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制和诱导凋亡作用,并分析Brucine在诱导细胞凋亡过程中对Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的调控作用。方法人乳腺癌细胞株MDA-MB-231（雌激素受体阴性）细胞以L-15培养基体外培养,用MTT法测定Brucine对细胞的增殖抑制作用;倒置显微镜观察细胞形态;以碘化丙啶（PI）单染流式细胞仪检测细胞凋亡;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测Brucine对MDA-MB-231的诱导凋亡作用;Western蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase3的表达。结果Brucine对MDA-MB-231细胞有明显的增殖抑制作用;观察到典型的细胞凋亡形态学特征性改变;流式细胞术PI染色结果显示随着Brucine浓度的增加细胞凋亡率逐渐增高并呈明显的浓度依赖,与对照组相比差异有显著性（P〈0.05）;早期凋亡率和晚期凋亡率先增加后降低,但死亡细胞逐渐增加;且随着Brucine浓度的增加抗凋亡基因Bcl-2表达水平明显降低,而促凋亡基因Bax和Caspase-3表达明显增高。结论Brucine能够诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,其分子机制可能与激活Bax、Caspase-3和抑制Bcl-2等凋亡调控基因有关。     

AKT体内外抗肝癌作用及机理的初步研究

目的：观察AKT对人肝癌细胞SMMC-7721及小鼠H22肝癌移植性肿瘤的抑制作用，并探讨以紫草总色素为主要成分，制备而成的AKT的抗肿瘤作用机制。方法：用MTT法分析AKT对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用绘制作用生长曲线；建立小鼠H22肝癌移植性实体瘤模型，通过绘制瘤块生长曲线及计算肿瘤抑制百分率评价体内抑瘤效果，流式细胞术检测不同剂量AKT作用SMMC-7721细胞48h后细胞凋亡率及细胞周期变化，并检测Bax及Bcl-2蛋白的表达情况；RT-PCR检测AKT作用SMMC-7721细胞24h后，bcl-2 mRNA及baxmRNA的表达情况。结果：（1）MTT提示AKT对SMMC-7721细胞具有显著抑制作用；（2）体内实验表明，AKT对小鼠H22肝癌移植性肿瘤有一定的抑制作用。（3）Giemsa染色后在光镜下可见AKT给药组多数细胞出现形态改变，胞体变小，胞质浓缩拉长，呈拉丝状，核质比增大，核膜完整，核固缩，染色质不均一或边集，胞浆内较多空泡的典型凋亡特征；Hoechst 33258染色后细胞核出现细胞核固缩，出现凋亡小体等明显的凋亡形态学变化；流式细胞术检测显示AKT作用SMMC-7721细胞后，中、高剂量组均检测到明显亚G1凋亡峰；给药组S期细胞明显降低，G2／M期细胞明显增多，细胞周期阻滞于G2／M期；药物处理后Bcl-2及Bax的表达均下调，且Bcl-2／Bax值降低；RT-PCR检测结果显示给药组bcl-2 mRNA及bax mRNA表达水平均出现下调，bcl-2／bax比值降低；体内实验瘤组织免疫组化结果显示给药组Bcl-2表达下调，Bax及Caspase-3表达均出现上调。结论：AKT对人肝癌SMMC-7721细胞具有明显体外抗增殖作用，对小鼠移植性肿瘤H22也呈现了明显的抑制作用。其效应机制可能与阻滞细胞周期于G2／M期，下调bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表达，上调Caspase-3表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖有关。     

黄芩素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

目的:研究黄芩素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法:以H22肝癌细胞接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下复制肝癌H22荷瘤模型。实验分为模型对照、环磷酰胺(30mg·kg-1)和黄芩素高、中、低剂量(80、40、20mg·kg-1)组。灌胃给药,每天1次,连续15d。末次给药后处死小鼠,剥离完整的肿瘤组织称重,并计算肿瘤抑制率;流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡率;按试剂盒说明书测定肿瘤组织中半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的活性;RT-PCR测定瘤组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平。结果:高、中剂量黄芩素可显著抑制模型小鼠体内肿瘤生长(P<0.01或P<0.05),抑制率分别为61.63%和44.65%;可显著提高G0/G1期细胞百分比(P<0.05),并减少S期细胞(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组比较,黄芩素高、中、低剂量组细胞凋亡率显著提高(P<0.01或P<0.05)。高、中剂量黄芩素可显著增强肿瘤组织中Capcase-3活性(P<0.01或P<0.05),抑制Bcl-2mRNA表达(P<0.01或P<0.05);高剂量黄芩素可显著提高肿瘤组织中BaxmRNA表达(P<0.05)。结论:黄芩素可促进肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤细胞的凋亡,其机制可能与增强Capcase-3活性、提高Bax表达,并抑制Bcl-2表达有关。     

石蒜碱诱导H22荷瘤小鼠体内肿瘤细胞凋亡的活性及机制研究

目的:探讨石蒜碱诱导H₂₂荷瘤小鼠体内肿瘤细胞凋亡的活性及其机制。方法:以昆明种小鼠为对象,通过前肢腋部皮下接种H₂₂肝癌小鼠腹水构建小鼠实体瘤模型,将造模后的小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组(羟基喜树碱6 mg/kg)和石蒜碱低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg),每组10只。阴性对照组小鼠灌胃等体积生理盐水,各给药组小鼠灌胃相应药物,每天1次,连续给药7天。末次给药后,检测小鼠的瘤体质量并计算抑瘤率。另通过腹腔注射H₂₂肝癌小鼠腹水构建小鼠腹水瘤模型,同法分组、给药。末次给药后,记录小鼠的生存时间并计算生存延长率,采用流式细胞术检测小鼠肿瘤细胞的早期凋亡率;在设立正常对照组(未荷瘤正常小鼠)的基础上,采用荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯染色法考察各组小鼠肿瘤细胞的线粒体膜通透性,采用Rhodamine 123染色法考察其线粒体电位变化,采用比色法和Western blot法分别检测其胱天蛋白酶3(Caspase-3)活性和凋亡相关蛋白[Bcl-2、Bax、细胞色素C(Cyt-C)、Caspase-9]的表达情况。结果:与阴性对照组比较,阳性对照组和石蒜碱各剂量组小鼠瘤体质量均显著降低,生存时间均显著延长,肿瘤细胞的早期凋亡率均显著升高(P<0.05或P<0.01);其抑瘤率分别为39.41%、23.36%、36.50%、56.93%,生命延长率分别为49.23%、29.09%、50.19%、69.08%。与正常对照组比较,阴性对照组小鼠肿瘤细胞线粒体膜通透性、Caspase-3蛋白活性以及Cyt-C、Caspase-9蛋白的表达水平均显著升高,线粒体膜电位、Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01);与阴性对照组比较,各药物组小鼠肿瘤细胞线粒体膜通透性和Bcl-2/Bax比值均显著降低,线粒体通透性、Caspase-3蛋白活性和Cyt-C、Caspase-9蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:石蒜碱可诱导H₂₂荷瘤小鼠体内肿瘤细胞凋亡,这种作用可能与其开放线粒体膜通透性转换孔以增加线粒体通透性、降低线粒体膜电位、诱导凋亡相关蛋白表达上调有关。     

秦皮乙素对小鼠皮下Hepa1-6肝癌移植瘤凋亡基因Bcl-2、Bax表达的影响

目的:研究秦皮乙素对小鼠皮下Hepa1-6肝癌移植瘤凋亡基因-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。方法:40只C57BL/6J小鼠右腋皮下接种Hepa1-6肿瘤细胞,复制小鼠肝癌皮下移植瘤模型。实验分为5组,即模型(生理盐水)、环磷酰胺和秦皮乙素高、中、低剂量(700、400、200mg·kg-1)组。复制模型后第3天开始腹腔注射给药,15d后处死小鼠取出瘤组织,称瘤重,计算抑瘤率。RT-PCR检测凋亡基因Bcl-2mRNA、BaxmRNA的表达,Westernblot法检测Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达。结果:秦皮乙素高、中、低剂量组抑瘤率分别为55.42%、40.37%、20.33%,与模型组比较有显著性差异(P<0.01);秦皮乙素高、中、低剂量组BaxmRNA和Bax蛋白的表达均显著高于模型组(P<0.01),Bcl-2mRNA和Bcl蛋白的表达均显著低于模型组(P<0.01)。结论:秦皮乙素对小鼠Hepa1-6肝癌瘤生长起到一定的抑制作用,其机制可能与通过上调Bax、下调Bcl-2基因的表达有关。     

消癌平注射液联合奥曲肽对H22荷瘤小鼠细胞凋亡的影响

目的观察消癌平注射液联合奥曲肽对H22肝癌移植瘤的抑瘤作用及其抑瘤的最佳药效浓度,并初步探讨其作用机制。方法建立小鼠皮下H22肝癌移植癌模型,成瘤后将实验动物随机分为8组:分别为模型组(生理盐水0.4ml/d),消癌平低、中、高剂量组(10、20、40g/kg),奥曲肽组(100μg/kg)及消癌平低、中、高剂量分别联合奥曲肽组。腹腔注射给药14d。计算各瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况,免疫组织化学方法测定凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2),Bcl相关X连锁蛋白(Bax)的表达情况;同时测定脾脏自然杀伤细胞(NK)活性。结果与模型组比较,各用药组对H22肝癌的生长均有一定的抑制作用,联合用药组的抑瘤作用优于单药组(P<0.05),以高剂量消癌平加奥曲肽的作用最好。高剂量消癌平及高剂量消癌平加奥曲肽组可使凋亡指数(AI)升高,下调Bcl-2的表达,上调Bax的表达,升高脾脏NK细胞活性,其中高剂量消癌平加奥曲肽组作用明显优于奥曲肽组和高剂量消癌平组。结论高剂量消癌平加奥曲肽为抑瘤的最佳药效浓度,其抑制肿瘤生长的作用可能与通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达诱导肿瘤细胞凋亡及增强脾脏NK细胞活性有关。     

枸杞多糖对小鼠海马神经元细胞系缺糖缺氧损伤保护作用及机制研究

目的探讨枸杞多糖(LBP)对小鼠海马神经元细胞系HT22细胞缺糖缺氧损伤保护作用的机制。方法采用含1 mmol/L连二亚硫酸钠的无糖DMEM培养基建立HT22细胞缺糖缺氧损伤模型,设对照组、模型组和LBP高、中、低剂量(100、50、25 mg/L)组,以CCK8法检测细胞活性,流式细胞术检测检测细胞凋亡情况;Western blotting检测Bcl-2、Bax蛋白表达情况;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TNF-α、NF-κB、I-κBα、Caspase-9基因转录活性。结果与对照组比较,模型组HT22细胞存活率显著降低、凋亡率显著增加(P<0.05);TNF-α、NF-κB、Caspase-9基因转录活性显著上调,I-κBα基因转录活性显著下调(P<0.05);Bax蛋白表达水平显著升高,Bcl-2的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,LBP各剂量组细胞存活率显著上升、凋亡率显著下降(P<0.05);TNF-α、NF-κB、Caspase-9基因转录活性显著下调,I-κBα基因转录活性显著上调(P<0.05);Bax蛋白表达水平显著降低,Bcl-2的蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。结论 LBP可能是通过下调TNF-α、NF-κB、Caspase-9基因转录活性以及Bax蛋白表达,增强I-κBα基因转录活性及Bcl-2的蛋白表达,抑制缺糖缺氧损伤诱导神经细胞凋亡的发生。     

环磷酰胺和紫杉醇联合化疗诱导小鼠Lewis肺癌细胞的凋亡

目的观察小剂量环磷酰胺(Ctx)和紫杉醇(Px)联合化疗对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响并探讨其可能的机制。方法建立小鼠Lewis肺癌模型,将38只C57BL/6♂小鼠随机分为4组:生理盐水对照组(A)、Ctx单药组(B)、Px单药组(C)、Ctx Px组(D)。采用免疫组化技术检测各组肿瘤组织中Bcl-2、Bax及Caspase-9的蛋白表达水平。结果D组Bcl-2蛋白表达水平明显低于A、B、C组,D组Bax、Caspase-9蛋白表达水平及Bax/Bcl-2则明显高于A、B、C组。结论小剂量Ctx和Px联合化疗比单用具有更强的促进小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用,其机制可能与增加Bax/Bcl-2比值和激活Caspase-9等有关。     

RY10-4对乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制

目的:探讨2-(1-羟基-4-酮-2,5-环己二烯)-吡喃-4-酮(RY10-4)对乳腺癌裸鼠移植瘤抑制作用及其可能的作用机制。方法:建立乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤模型,将造模裸鼠随机分为模型组、RY10-4低剂量组(7.5 mg·kg^-1)、 RY10-4高剂量组(15 mg·kg^-1)和紫杉醇组(15 mg·kg^-1);各组均采取隔天腹腔注射给药,检测各组荷瘤裸鼠移植瘤体积和体质量变化。给药16 d后,处死所有裸鼠,称取各组移植瘤质量,TUNEL法检测凋亡指数,并通过Western blot测定移植瘤中Bcl-2、Bax和MAPK 通路蛋白的表达。结果:与模型组比较,RY10-4低、高治疗组和紫杉醇组瘤体积明显减小,瘤质量明显减轻,抑瘤率分别为29.8%,47.2%,53.8%。TUNEL法结果显示,各治疗组能明显引起移植瘤细胞凋亡(P<0.01)。Western blot结果显示,随着RY10-4治疗量的增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱,促凋亡蛋白Bax的表达增强,Bcl-2/Bax值显著下降,与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05);另外,RY10-4治疗组移植瘤细胞中的p-p38和p-ERK表达量明显增加。结论:RY10-4能够抑制乳腺癌移植瘤的生长和诱导乳腺癌细胞的凋亡,其诱导凋亡作用可能与下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白,降低Bcl-2/Bax值,并激活p38和ERK信号通路有关。     

柚皮素对氧化应激所致成骨细胞凋亡的影响及机制研究

目的：观察柚皮素对氧化应激导致的成骨细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法体外分离培养成骨细胞,细胞分空白对照组、单纯 H2 O2作用组、H2 O2＋0 J．1μmol／L 柚皮素组、H2 O2＋1μmol／L柚皮素组、H2 O2＋10μmol／L柚皮素组。 MTT法检测成骨细胞活力;流式细胞术检测成骨细胞凋亡率;荧光显微镜观察活性氧（ ROS）含量;比色法检测丙二醛（ MDA）含量;Real time-PCR和Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达情况。结果与空白对照组比较,单纯H2 O2处理组细胞活性明显降低,凋亡率及ROS、MDA含量明显增加;同时Bcl-2 mR-NA和蛋白表达明显下调,Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显上调（ P ＜0．05）。与单纯H2 O2处理组比较,柚皮素预处理24 h能够明显增强细胞活性,降低细胞凋亡率及ROS、MDA含量,上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,下调Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达,呈剂量依赖性（ P ＜0．05）。结论柚皮素在氧化应激条件下能够促进成骨细胞增殖,抑制成骨细胞凋亡,其机制与上调Bcl-2表达,下调Bax、Caspase-3表达有关。