人心肌肌钙蛋白I基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）基因原核表达载体的构建，获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni—NTA树脂纯化，纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备抗血清。通过ELISA，Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnI的原核表达载体，并在大肠埃希菌中荻得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

目的 进行人心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)基因原核表达裁体的构建,获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化,纯化后的融合蛋白免疫小鼠,制备抗血清.通过ELISA,Western blot鉴定血清效价和特异性.结果 成功构建了cTnI的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达.Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体.结论 成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体.     

可生物素化H-2K~d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的] 构建和表达乙型肝炎病毒x基因原核表达载体，获得重组HBx蛋白。[方法] 用PCR方法扩增含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，分别以pMD18-T载体和pET32a（＋）载体构建pMD18-T-HBX克隆载体和pET32a-HBX原核表达载体，随后把pET32a-HBX转化大肠杆菌BL-2l进行诱导表达和纯化，Western blot检测原核表达的HBx蛋白的免疫活性。[结果] 经IFFG诱导后可见分子量约38KD的融合蛋白表达；表达的蛋白主要以包涵体形式存在；Western blot结果表明HBx融合蛋白具有较好的免疫活性。[结论] HBVX基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化。为研究HCC患者血清中HBx蛋白和抗-HBx抗体滴度水平奠定了坚实的基础。     

可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建町生物素化的H-2K^d-BSP融合基因的表达载体，原核表达H-2K^d-BSP融合蛋白，以制备H-2K^d-肽四聚体。方法采用RT—PCR技术从小鼠SP2／0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2K^d基因的胞外区，拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列（BSP）后，插入pET-22b高效表达载体多克隆位点，诱导表达后对表达产物进行纯化，用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2K^d-原核表达载体，测序证实H-2K^d-BSP融合基因序列正确。pET—H-2K^d原核表达载体可在大肠枰菌BL21中高效诱导表达H-2K^d-BSP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的36％，主要以包涵体形式表达；经反复洗涤纯化，纯化蛋白纯度可达90％以上。纯化蛋白可被H-2K^d分子特异性单克隆抗体SF1—1．1所识别。结论可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2K^d-肽四聚体奠定了实验基础。     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定

目的构建抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,在大肠杆菌里表达,并鉴定及纯化。方法采用PCR的方法,扩增融合基因DAB389-Linker-CD133(scFV),并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a-DAB389-CD133,融合蛋白在BL21(DE3)中表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,通过Ni柱纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的DAB389-Linker--CD133(scFV)融合蛋白。Western blot鉴定蛋白活性。流式细胞仪检测能否与CD133抗原特异性结合。结果扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;纯化得到纯度为95%的重组蛋白。Western blot分析能特异性地与抗白喉抗体结合。流式细胞仪检测能与CD133抗原特异性结合。结论成功构建了抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,具有结合抗原和免疫毒素双重活性,为进一步靶向治疗奠定了基础。     

人BIGH3基因克隆表达对兔角膜基质细胞黏附和迁移的影响

背景:BIGH3蛋白位于角膜上皮和基质层,在基质层高表达,先前研究已经发现BIGH3蛋白能促进角膜上皮创伤愈合,为此进一步探讨其对角膜基质创伤愈合的影响.目的:构建人BIGH3基因的原核表达载体,观察其对角膜细胞与细胞外基质黏附和迁移的作用.方法:PCR扩增BIGH3基因的ORF阅读框,并通过Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ插入到原核表达载体pET32a(+)中.经PCR、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒.将重组质粒转入BL21(DE3)表达,IPTG诱导表达人BIGH3融合蛋白,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析:以Ni-NTA树脂对蛋白纯化与复性,作用于体外培养的兔角膜细胞,用MTT法分析其对细胞与细胞外基质黏附的影响,采用改良的Boyden微孔膜双槽法观察BIGH3蛋白对角膜细胞迁移的影响.结果与结论:重组质粒经PCR、酶切与DNA测序证实插入了pET32a(+)载体中.通过IPTG诱导,成功的表达融合蛋白在包涵体中,经SDS-PAGE电泳分析,出现了一条新生的蛋白条带,Western blot也证实了该蛋白具有与BIGH3抗体特异性的结合能力.MTT法和Boyden微孔膜双槽法分别证明所表达的BIGH3融合蛋白可促兔角膜细胞黏附和迁移.成功构建了人BIGH3重组融合蛋白表达质粒,纯化了该基因的原核表达产物,并通过重组融合蛋白BIGH3能促进兔角膜细胞与细胞外基质黏附及迁移,而验证了重组BIGH3蛋白的活性.     

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。     

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的 构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白.方法 根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的 片段,建立了RT-PCR检测方法.应用RT-RCR方法 扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA.将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6 mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达.通过Western blot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性.结果 所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,目的 蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%.通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6 h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果 相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白.结论 成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础.     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

护士选择性应用静脉留置针现状分析

[目的]了解护士选择性应用留置针的现状以及主要影响因素,为指导临床留置针合理应用提供理论依据。[方法]采用自设问卷对138名护士留置针选择性使用情况及其影响因素进行调查。[结果]约1／4的护士并不知道应选择性使用留置针,近60％的护士在实际工作中选择留置针的意识较差;护士选择性应用留置针的决策受多因素影响;不同科室、职称及是否具有带教资格选择性应用留置针的影响因素不尽相同;绝大部分护士希望参加选择性应用留置针相关内容的培训。[结论]临床护士操作前考虑留置针选择的意识有待加强。建议实施有针对性的培训以提高护士选择性应用留置针的能力。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。