人脐带间充质干细胞分离培养及成骨分化*

背景：目前,人们对间充质干细胞的观察研究多采用扫描电镜、透射电镜和倒置显微镜等,但是这几种方法对观察细胞膜超微结构及细胞骨架的研究则有不足之处。 目的：探讨并优化人脐带间充质干细胞体外获取及培养增殖的方法并鉴定;应用原子力显微镜观察其向成骨诱导过程中超微结构的变化。 方法：用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,通过传代培养,扩增。体外向骨方向诱导分化,并通过碱性磷酸酶钙钴法染色、茜素红染色鉴定其分化能力。流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞免疫表型;诱导过程中利用原子力显微镜的高空间分辨率从可视化的角度观察其在诱导前后细胞表面超微结构的变化。 结果与结论：采用酶消化法能有效分离纯化人脐带间充质干细胞。接种24 h,贴壁细胞形态多为长梭形,多边形或成纤维细胞样形态,大小均一。流式细胞仪分析第3代细胞均表达CD29、CD44 、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR。经成骨诱导分化4周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;通过原子力显微镜对分化前后的细胞骨架分析：未分化的干细胞其细胞骨架的微管突出不明显,分化后的细胞骨架其微管明显突出,并呈平行分布状态。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展

背景：人脐带间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,具有来源丰富,对供者无影响,易于采集和运输,无异体排斥反应,避免伦理争议等诸多优点。 目的：综述人脐带间充质干细胞的生物学特性及其应用进展。 方法：以“人脐带间充质干细胞,生物学特征,基因分析,诱导分化, human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUMSCs),biocharacteristics, gene analysis,induce differentiation”为关键词应用计算机检索CNKI数据库、万方数据库、PubMed数据库文章。 结果与结论：人脐带间充质干细胞呈典型的成纤维状,其表达的表面标志抗原具有非单一性,高表达间质细胞标志、整合素受体,不表达造血系标志、协同刺激分子CD80、CD86 和CD40、人白细胞抗原HLA-DR,HLA-G,HLA-DP,HLA-DQ、内皮标志CD31或CD33、CD14、CD56等。人脐带间充质干细胞与造血干细胞和胚胎干细胞类似,在体外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞等;在体内可以分化为多巴胺能神经元、骨骼肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞等。但人脐带间充质干细胞的研究仍存在亟需解决的问题,如分离方法、培养条件的规范化,如何控制其生长和分化等。     

c/000脐带组织间充质干细胞分离及生物学特性

背景：脐带组织依赖于母体免疫系统的保护,且胚胎自身免疫系统相对不发育、MHC表达低下,故来源于脐带的间充质干细胞的生物学特性已成为目前研究热点。 目的：拟在体外分离培养人脐带组织间充质干细胞,并观察其多向分化能力。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-10/2007-05在四川大学组织工程重建实验室完成。 材料：脐带来源于胎龄37~40周的健康新生儿,由四川大学华西第二医院产房提供。 方法：取脐带沿血管长轴切开,去掉血管,再将脐带重新缝合形成环状,灌入胶原酶悬液,6~8 h后灌洗离心,获取细胞后贴壁法分离培养、扩增,细胞呈集落生长后传代。取传至第5代细胞,分别加入成骨、成脂诱导分化培养基。 主要观察指标：脐带间充质干细胞的形态、生长状况、表面抗原分子的表达、多向分化潜能。 结果：去除血管后获取脐带组织细胞的方法可获得贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形样细胞,易扩增和形成集落;高表达基质细胞抗原CD29,CD51,CD71,而不表达CD34,CD45及HLA-DR等造血干细胞抗原分子;成骨诱导后茜素红染色胞浆中有大量的钙沉积,碱性磷酸酶钙钴法染色胞质呈灰黑色,阳性细胞率>85%;成脂诱导后油红O染色示胞浆充满油滴空泡。 结论：脐带组织存在具有分化能力的间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,传代细胞表达基质细胞表面抗原,能够向成骨细胞、成脂肪细胞方向分化。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景：间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。 目的：观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。 方法：无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。 结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105+/CD29+/CD44+/CD31-/CD34-/CD45-/HLADR-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3~23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P < 0.01),第3~18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P > 0.05)。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3~18代之间。     

葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长与代谢的影响

背景：目前对人脐带间充质干细胞的研究主要集中于细胞生物学特性与组织分化等领域的研究,对细胞代谢途径调控的报道还很少。 目的：考察了不同起始浓度的葡萄糖对人脐带间充质干细胞生长和代谢特征的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-02/06在北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理研究室完成。 材料：采集产妇遗弃健康足月分娩胎儿脐带4份。 方法：①从人脐带组织Wharton’s Jelly中成功分离出人脐带间充质干细胞,采用流式细胞仪对分离培养的第3代人脐带间充质干细胞免疫分型进行分析。②将细胞以2.5×107 L-1接种于24孔板中,在含有不同起始葡萄糖浓度（0.31,2.78,6.12,21.58 mmol/L）、体积分数为0.10 FBS的DMEM培养基中培养,每隔24 h取样计数。③将细胞以2.5×108 L-1的密度接种于25 cm2方瓶中培养96 h后,收集不同葡萄糖浓度作用后的细胞,采用流式细胞仪进行细胞周期分析。④将细胞以2.5×108 L-1密度接种于含有不同起始葡萄糖浓度DMEM培养基75 cm2方瓶中,培养96 h后,离心收集上清和细胞,分别用于细胞代谢物检测与酶活性分析。 主要观察指标：①人脐带间充质干细胞细胞形态和表面抗原表达。②细胞生长情况。③细胞周期检测。④细胞胞内外营养物、代谢副产物及酶活性的测定分析。 结果：①采用流式细胞仪对人脐带间充质干细胞进检测,阳性表达的有CD13,CD29,CD44,CD105,CD147,CD90,CD71,表达率均高于90%,而造血干细胞特有标记CD34,CD45及白细胞抗原HLA-DR、CD38呈阴性表达。②葡萄糖能促进人脐带间充质干细胞的生长,但当培养基中缺失葡萄糖时,细胞也可维持生长,在120 h细胞达到最高密度11.6×107 L-1。 ③细胞群体在G0/G1期的分布比例显著高于S期和G2/M期,随着葡萄糖浓度的增加,细胞群体处于G0/G1期的比例逐渐降低,S期相应增加。④当葡萄糖浓度为21.58 mmol/L时,己糖激酶与丙酮酸激酶活性分别比缺失葡萄糖时增加了39.7%和64.3%,而谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸等氨基酸的比消耗速率却随着葡萄糖浓度的增加而显著降低。 结论：当培养基中缺失葡萄糖时,细胞可利用氨基酸等营养物维持生长;随着葡萄糖浓度的增加,细胞周期分布和葡萄糖代谢途径关键酶活发生改变,从而影响了人脐带间充质干细胞的生长与代谢特征。     

大鼠肌肉注射移植人脐带间充质干细胞的安全性

背景：目前国内关于间充质干细胞肌肉注射安全性方面的研究报道较少。 目的：观察人脐带间充质干细胞肌肉注射后,移植大鼠各项生理指标及注射局部肌肉组织的病理学变化。 方法：SPF级雄性Wistar大鼠51只,取3只作为空白对照,剩余48只随机均分为4组：低、中、高浓度细胞移植组分别于大鼠左下肢腓肠肌外侧肌肉注射2.5×109 L-1,5×109 L-1,1.5×1010 L-1人脐带间充质干细胞悬液,共注射2个位点,每个位点注射0.1 mL,2个位点间隔约0.5 cm;溶媒对照组同法注射50 g/L葡萄糖溶液。分别于注射后1 d及1,2,4周进行大鼠尿常规、血液学、血液生化学和病理组织学检查。 结果与结论：人脐带间充质干细胞肌肉注射后对大鼠尿常规及肝脏、肾脏均无明显影响;仅引起总胆红素一过性升高,以及血小板、乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶轻度炎症反应性升高;高浓度细胞移植可引起肌肉注射局部明显炎症反应。提示人脐带间充质干细胞免疫原性极低,在掌握了细胞移植的适宜浓度及剂量的前提下,以肌肉注射的方式进行异种移植不会引起受者严重的免疫排斥反应。     

人脐带间充质干细胞治疗阿尔茨海默病机制的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)是发生于老年及老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性疾病.当今世界人口日趋老龄化,AD发病率逐年升高,对国家和社会造成沉重负担.近年来人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell,hUC-MSC)移植治疗已成为治疗AD的研究热点之一.本文对hUC-MSC的特性及治疗AD的机制做一综述.     

人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性

背景：由于大量获取骨髓细胞存在困难,并且骨髓间充质干细胞随年龄的增加出现数量及分化潜能下降,因此需要寻找其他间充质干细胞来源。 目的：优化人脐带间充质干细胞的分离培养条件,进一步明确其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006-09/2008-03在中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室完成。 材料：17份脐带标本取自健康足月新生儿,由天津市中心妇产医院提供。 方法：脐带采集后在6 h内分别用植块法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶联合消化法进行分离培养,于培养第14天计数集落数,超过50个细胞计为集落。当细胞达70%~80%融合时,胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合消化,以(2.5~5.0)×103/cm2密度传代培养。 主要观察指标：比较不同培养方法所获贴壁细胞的形态学特征、细胞产率,应用流式细胞技术分析细胞增殖活性、免疫表型,特异性染色方法鉴定细胞的多向分化潜能。 结果：植块法培养6~10 d可见成纤维样细胞从植块边缘爬出,形态与骨髓间充质干细胞相似,散在分布或形成小克隆,原代可获得(5.2±1.7)×105个贴壁细胞/0.5 cm脐带组织,至少可稳定传15代,平均每代扩增6.2倍,在原代细胞克隆数、细胞产率、传代时间及扩增倍数上与胶原酶消化法比较存在明显差异(P < 0.05);而胶原酶与胰酶联合消化法接种后未见明显贴壁细胞。人脐带间充质干细胞的倍增时间为45 h,72.09%细胞处于G0/G1期,不表达造血细胞及内皮细胞标记,高表达整合素和黏附分子CD44,CD90,CD95以及CD73,CD105,在特定诱导条件下,人脐带间充质干细胞能够向成骨及成脂肪细胞方向分化。 结论：应用植块法可以从人脐带组织中简便高效地分离出一群具有高增殖活性及多向分化潜能的间充质干细胞,其免疫表型类似于骨髓间充质干细胞。     

人脐带沃顿胶间充质干细胞与脑肿瘤干细胞的共培养**

背景：人脐带沃顿胶间充质干细胞满足了国际细胞治疗协会规定的间充质干细胞的特点,能够向骨、软骨、脂肪、肌肉、神经细胞诱导分化并支持其他干细胞的扩增,对免疫系统有良好的耐受性,对肿瘤有定向迁徙性。 目的：观察人脐带沃顿胶间充质干细胞与脑肿瘤干细胞体外共培养后,脑肿瘤干细胞的生物学变化。 方法：以原位法培养人脐带沃顿胶间充质干细胞,以酶消化法培养人脑肿瘤组织脑肿瘤干细胞,以细胞传代法获取第3代细胞。应用不添加任何生长因子的无血清培养基将两种细胞在24孔板中进行直接共培养。第3,7天应用流式细胞术检测细胞CD133表达;应用免疫荧光法检测贴壁细胞巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达;将第3天离心所得的共培养上清液重悬第3代脑肿瘤干细胞并与正常培养悬浮的第3代脑肿瘤干细胞置入96孔板中,应用酶标仪检测两组细胞生长曲线的差异。 结果与结论：两种细胞共培养后在倒置显微镜下可见脑肿瘤干细胞球随着培养时间的增加出现分解、贴壁、分化现象;贴壁的脑肿瘤干细胞免疫荧光染色胶质纤维酸性蛋白和巢蛋白均阳性。恶性程度高的脑肿瘤组织培养的脑肿瘤干细胞表达CD133量越高,而与沃顿胶间充质干细胞共培养后随着时间的变化均出现CD133表达量降低。共培养3 d的上清液培养的脑肿瘤干细胞与正常培养基培养的脑肿瘤干细胞相比,增殖明显受到抑制。结果显示沃顿胶间充质干细胞与脑肿瘤干细胞体外共培养后可限制脑肿瘤干细胞表面标记物CD133的阳性率以及细胞增殖能力并促使其分化。     

大鼠脐带源间充质干细胞的分离及生物学性状**☆

背景：关于大鼠骨髓来源的间充质干细胞用于移植免疫耐受及进行组织修复的研究很多,但尚无脐带来源间充质干细胞的相关研究。 目的：建立从大鼠脐带分离间充质干细胞的方法,并观察其生物学性状。 方法：大鼠脐带经酶消化和组织块培养两种方法进行分离培养,于DMEM-LG培养基中培养,倒置显微镜观察细胞形态,细胞计数绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及细胞表型,免疫组织化学染色检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力。 结果与结论：两种方法均能成功地从大鼠脐带中获得大量的间充质干细胞：原代培养显示,胶原酶消化法比组织块培养法的效率更高,大约10 d就可以进行传代,而组织块培养法要14 d才能传代;传代扩增两者之间没有差别。免疫表型分析显示,大鼠脐带源细胞表达黏附分子和基质细胞标记CD90、CD106,不表达造血细胞标记CD34、CD45。体外诱导实验证实,大鼠脐带间充质干细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。     

人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特征*◆

背景：冻存脐带间充质干细胞,并有效地保持其生物学特性,是储存脐带间充质干细胞以供临床使用的重要工艺之一。 目的：观察冻存后脐带间充质干细胞的生物学特性,验证其是否仍具有间充质干细胞的基本特征。 方法：从脐带分离得到间充质干细胞后,将其冻存于液氮之中。比较经冻存复苏后的脐带间充质干细胞和新鲜制备的脐带间充质干细胞活率、抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素等方面的异同。检验经冻存复苏后的脐带间充质干细胞是否具有多向分化潜能,其表型是否满足间充质干细胞的基本特征。 结果与结论：在细胞活率和抑制人外周血单个核细胞分泌γ-干扰素方面,冻存和新鲜的脐带间充质干细胞差异无显著性意义。经冻存复苏后的脐带间充质干细胞保持了间充质干细胞的基本形态,其表型满足间充质干细胞的基本要求,具有多向分化的潜能。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。     

Cytotoxicity of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells against human malignant glioma cells

Background Mesenchymal stem cells (MSCs) represent a potential useful source for cell-based glioma therapies because these cells evidence both orthodox and unorthodox plasticity and also show tropism for cancer. In this study, the authors attempted to access the cytotoxicity of human umbilical cord blood (hUCB)-derived MSCs, with or without cytokine activations against malignant glioma cells. Materials and methods hUCB-derived MSCs were activated by interleukin-2, interleukin-15, granulocyte macrophage colony-stimulating factor, and combinations. The hUCB-derived MSCs and activated hUCB-derived MSCs were effector cells. The cytotoxicity of the unactivated hUCB-derived MSCs and activated hUCB-derived MSCs against the target cells (human malignant glioma cells) was estimated via visual survival cell assays and transwell inserts. Phenotypic changes occurring in these hUCB-derived MSCs before and after cytokine activation were determined via flow cytometry. The secreted proteins from these effector cells were estimated via enzyme-linked immunosorbent assays. Results We noted a significant cytotoxicity of hUCB-derived MSCs against malignant glioma cells. In addition, the hUCB-derived MSCs activated with cytokines evidenced significantly higher cytotoxicity than that observed with unactivated hUCB-derived MSCs. Differentiated immune effectors cells from the hUCB-derived MSCs after cytokine activation were not shown to have increased in number. However, the activated hUCB-derived MSCs secreted more immune response-related proteins (interleukin 4, interferon-γ) than did the unactivated hUCB-derived MSCs. Conclusion The data collected herein confirm for the first time that hUCB-derived MSCs, with or without activation, evidence significant cytotoxicity against human malignant glioma cells, and the immune response-related proteins secreted in this process may perform relevant functions.     

Transplantation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord versus human umbilical cord blood for peripheral nerve regeneration

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be a good alternative to Schwann cells in the treatment of peripheral nerve injury. Fetal stem cells, like umbilical cord blood (UCB) and umbilical cord (UC) stem cells, have several advantages over adult stem cells.OBJECTIVE: To assess the effects of UC-derived MSCs (UCMSCs) and UCB-derived MSCs (UCBMSCs) in repair of sciatic nerve defects. DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized controlled animal experiment was performed at the laboratory of Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Seoul National University Dental Hospital, from July to December 2009. MATERIALS: UCMSCs were provided by the Research Institute of Biotechnology, Dongguk University. UCBMSCs were provided by the Laboratory of Stem Cells and Tumor Biology, College of Veterinary Medicine, Seoul National University. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) was purchased from Gibco-BRL, USA. METHODS: Seven-week-old Sprague-Dawley rats were randomly and evenly divided into three groups: DMEM, UCBMSCs, and UCMSCs. A 10-mm defect in the left sciatic nerve was constructed in all rats. DMEM (15 μL) containing 1 × 106 UCBMSCs or UCMSCs was injected into the gap between nerve stumps, with the surrounding epineurium as a natural conduit. For the DMEM group, simple DMEM was injected. MAIN OUTCOME MEASURES: At 7 weeks after sciatic nerve dissection, dorsal root ganglia neurons were labeled by fluorogold retrograde labeling. At 8 weeks, electrophysiology and histomorphometry were performed. At 2, 4, 6, and 8 weeks after surgery, sciatic nerve function was evaluated using gait analysis.RESULTS: The UCBMSCs group and the UCMSCs group exhibited similar sciatic nerve function and electrophysiological indices, which were better than the DMEM group, as measured by gait analysis (P < 0.05). Fluorogold retrograde labeling of sciatic nerve revealed that the UCBMSCs group demonstrated a higher number of labeled neurons; however, the differences were not significant. Histomorphometric indices were similar in the UCBMSCs and UCMSCs groups, and total axon counts, particularly axon density (P < 0.05), were significantly greater in the UCBMSCs and UCMSCs groups than in the DMEM group. CONCLUSION: Transplanting either UCBMSCs or UCMSCs into axotomized sciatic nerves could accelerate and promote sciatic nerve regeneration over 8 weeks. Both treatments had similar effects on nerve regeneration.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景：多项研究表明间充质干细胞具有向肝细胞分化的潜能,这将为肝细胞移植、生物人工肝、肝组织工程提供大量种子细胞,也有望在急性肝衰竭、终末期肝病和遗传代谢性肝脏疾病治疗方面带来较大突破。 目的：拟在体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化,观察其形态及功能变化。 方法：取体外培养第3代处于对数生长期的人脐带间充质干细胞,以1×109 L-1的细胞浓度种植在培养瓶中,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,设立3组：实验1组加入20 μg/L肝细胞生长因子+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,实验2组在其基础上另加入20 μg/L制瘤素,空白对照组不加入任何生长因子。根据细胞生长情况,每周换液两三次。分别于培养7,14,18 d在倒置显微镜下观察细胞形态,采用免疫细胞化学检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18的表达,运用PAS法检测糖原的表达。 结果与结论：人脐带间充质干细胞可在含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L制瘤素、体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养体系中诱导分化为具有肝细胞表型和功能的细胞,且肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、制瘤素联合应用的诱导效果优于单纯应用前两者。     

人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化,以期为脐带MSCs的神经移植提供理论依据。方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,酶消化法获取MSCs,进行培养。用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。取扩增3,5,10代的MSCs分别向神经元样细胞诱导,用免疫组化和RT-PCR法检测神经元样细胞特异性标志。结果脐带富含MSCs,且脐带MSCs(UCMSCs)强表达CD13、29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33、CD45。神经条件培养基诱导后的细胞平均有70%左右呈现典型的神经元样表型。免疫组化法检测发现不同代数的MSCs经诱导后均表达nestin,NSE,NeuN,NF-M,弱表达GFAP。RT-PCR显示诱导后NSEmRNA表达增加。结论MSCs存在于人脐带中,并且在体外有较强的增殖能力,特定条件下能够分化为神经元样细胞。     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。 目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3 h 3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4 mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。 结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多(P < 0.05)。在作用3 h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组(P < 0.01)。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2 h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙的生物相容性

背景：体内实验显示,β-磷酸三钙多孔陶瓷是较为理想的骨组织工程支架材料,但由于体内植入实验受多种因素的影响,不能很好反映细胞的生长、增殖和表型变化。 目的：观察体外人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙多孔陶瓷的生物相容性。 方法：将培养的第6代人脐血间充质干细胞悬液滴注入β-磷酸三钙内部进行复合,然后将干细胞-支架材料复合物置入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养体系中培养,于培养第4,8,12天电镜下观察人脐血间充质干细胞在材料表面及内部生长情况,采用MTT测试法绘制细胞生长曲线,并进行DNA含量、蛋白质含量测定。 结果与结论：人脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙体外复合后能够在β-磷酸三钙支架材料表面及内部的孔隙内贴附,且生长良好,其DNA复制和蛋白合成功能不受β-磷酸三钙的影响。说明人脐血间充质干细胞和β-磷酸三钙支架材料生物相容性良好,二者可作为种子细胞和支架材料用于组织工程化骨与软骨的构建。     

人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的研究

目的研究人脐带分离的间充质干细胞向神经细胞分化的可能性。方法将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞;经传代培养、细胞周期分析、流式细胞检测后,再以不同方案诱导向其神经细胞分化,并以免疫荧光和RT-PCR方法进行鉴定。结果培养5-7d后,有细胞从组织块中游出。细胞传代培养达23代后无明显的形态和增殖能力改变。细胞周期分析表明80%以上的细胞都处于G0~G1期。流式细胞检测表明这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105和CD166等MSCs标志物。经神经分化诱导后,部分细胞呈现出与神经元或神经胶质细胞类似的形态;免疫荧光检测表明,第二神经分化诱导方案优于第一方案,其NSE和MBP阳性细胞分别达80.8%±3.9%、4.2%±1.3%,但未能见到GFAP阳性细胞。RT-PCR进一步证实了这些神经标志物的表达。结论人脐带间充质干细胞具有向神经细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。