神经节苷脂对染砷人脑皮层神经元的保护作用

 目的研究神经节苷脂对As2O3体外干预的皮质神经元的保护作用及可能机制。方法将人原代脑皮质神经细胞分为 5组,空白对照组、5 μmol·L^-1 As₂O₃干预组和5μmol·L^-1 As₂O₃加神经节苷脂50,100,200 μg·L^-1组,Fluo-3/AM荧光探针标记皮质神经元胞浆钙([Ca²⁺]i),激光共聚焦显微镜实时测定[Ca²⁺]_i的变化。磷基转移法测定细胞膜和胞浆的蛋白激酶C(PKC) 的活性。流式细胞仪检测细胞凋亡百分比。结果 5 μol·L^-1的As₂O₃,作用3 min,[Ca²⁺]_i开始升高,并随时间延长逐渐明显,As₂O₃加神经节苷脂200 μg·L^-1,作用9 min,[Ca²⁺]i才开始升高,且程度远没有As2O3组明显。5 μmol·L^-1的As₂O₃组的 PKC活化程度明显高于As₂O₃加神经节苷脂组,以细胞膜相明显。24 h凋亡率分别为:As₂O₃组78.5%,As₂O₃加神经节苷脂 200μg·L^-1组13.5%。结论神经节苷脂抑制As₂O₃引起的皮质神经元的[Ca²⁺]i升高和PKC活化,抑制细胞凋亡。并通过对细胞膜靶点的保护来实现对神经细胞的保护作用,这进一步证明砷剂最初的作用靶点是细胞膜。     

灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞胞浆游离Ca2+浓度的影响

 目的:探讨灵芝多糖(GLP)对免疫细胞信号转导过程的影响?方法:采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术,动态监测GLP均一体组分GLB₇对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)胞浆游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)的影响?结果:GLB₇(20μg·ml^-1)引起小鼠腹腔MΦ中[Ca²⁺]i明显升高,升高值为(248±18)%(n=6);GLB₇引起小鼠腹腔MΦ外钙内流及MΦ内IP₃敏感和IP₃非敏感钙池释放Ca²⁺,[Ca²⁺]i升高值分别为(76±10)%,(58±10)%,(41±8)%(n=6);GLB₇对MΦ[Ca²⁺]i的影响与K⁺通道及其引起的膜电位变化无关?结论:MΦ是灵芝多糖作用的靶细胞;GLB₇引起MΦ中[Ca²⁺]i快速升高,可能是灵芝多糖产生作用的重要途径?     

蚓激酶对活化血小板[Ca2+]i、JNK1和P-选择素表达的影响

 目的 研究蚓激酶(lumbrokinase, LK对大鼠血小板内钙离子浓度（intracellular calcium concentration, [Ca²⁺]_i、c-Jun氨基末端激酶-1 (c-Jun N-terminal kinase-1, JNK1以及人血小板P-选择素(P-selection, Ps表达水平的影响,阐明LK抗血小板活化的部分机制。方法 用荧光分光光度计测定LK对大鼠血小板活化过程中胞浆[Ca²⁺]_i的影响;免疫蛋白印记方法检测LK对大鼠血小板JNK1磷酸化水平的影响;流式细胞仪测定LK对人血小板活化过程中Ps表达水平的影响。结果 LK高剂量组（100 mg·L^-1和中剂量组（50 mg·L^-1大鼠血小板[Ca²⁺]_i分别为（425.49±37.4 nmol·L^-1和（509.65±35.67 nmol·L^-1,与诱导组血小板[Ca²⁺]_i （555.59±39.71 nmol·L^-1相比显著降低（P<0.01,P<0.05;LK高剂量组（100 mg·L^-1和中剂量组（50 mg·L^-1大鼠血小板JNK1磷酸化水平分别为（0.60±0.069和（0.79±0.048,与诱导组血小板JNK1磷酸化水平（0.87±0.037相比显著降低（P<0.01,P<0.05;LK高剂量组（100 mg·L^-1和中剂量组（50 mg·L^-1人血小板Ps水平为（42.99±2.69和（44.72±2.09,与诱导组（49.99±3.81相比显著降低（P<0.01,P<0.05。结论 体外实验表明LK能够抑制大鼠血小板胞浆[Ca²⁺]_i升高和JNK1的磷酸化,同时也能抑制人血小板Ps的表达水平的升高,从而起到抗血小板活化作用。     

双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca2+]i的影响

 目的研究双苯氟嗪(Dip)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑神经细胞胞浆Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)变化的影响。方法将400pmol的内皮素-1(ET-1)灌注到大鼠大脑中动脉附近制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,以Fura-2/AM作为钙荧光指示剂,双波长荧光分光光度法检测灌注ET-1后不同时间大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca²⁺]_i的变化及Dip对灌注ET-1后4h胞浆[Ca²⁺]_i变化的影响,并采用TYC染色法观察了Dip对灌注ET-1后24h脑梗死范围的影响。结果灌注400pmolET-1诱发大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后,大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca²⁺]_i明显升高,并于灌注EF-1后4h达峰值,随着再灌注时间的延长,胞浆[Ca²⁺]_i逐渐降低;Dip20,40mg·kg^-1可以明显降低灌注ET-1后4h大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca²⁺]_i的升高(P<0.01),Dip10mg·kg^-1组虽表现出一定的降低胞浆[Ca²⁺]_i的作用,但与溶剂组比较,差异无显著性(P>0.05);对脑梗死范围的测定结果显示,Dip可以缩小脑梗死范围,其作用呈现明显的剂量依赖关系(r=0.9797,P<0.01)。结论Dip对抗脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca²⁺]_i升高可能是其产生神经保护作用的重要机制。     

龙葵碱诱导HepG2细胞凋亡的线粒体通路研究

 目的观察龙葵碱诱导HepG₂细胞凋亡与线粒体通路的关系。方法MTT法测定龙葵碱对HepG₂细胞的细胞毒作用;AO/EB双染,激光共聚焦扫描显微镜观察龙葵碱对HepG₂细胞形态学的影响;TMRE和Fluo-3/AM双染,激光共聚焦扫描显微镜同时观察细胞线粒体膜电位和细胞内[Ca²⁺]_i的变化。结果龙葵碱对HepG₂细胞有细胞毒作用;龙葵碱诱导HepG₂细胞形态出现凋亡形态时TMRE和Fluo-3/AM双染观察表明,龙葵碱在降低线粒体膜电位的同时能够升高细胞内[Ca²⁺]_i浓度。结论龙葵碱降低膜电位,开放细胞膜PT通道,使细胞内Ca²⁺顺浓度梯度转运,从而升高细胞内Ca²⁺浓度启动细胞凋亡机制。     

氧化苦参碱对豚鼠单个心室肌细胞胞浆[Ca2+]i的影响

 目的 观察氧化苦参碱对急性分离的豚鼠单个心室肌细胞内游离钙离子浓度([Ca²⁺]_i)的影响。方法 采用酶解法分离豚鼠单个心肌细胞,用钙敏感的荧光指示剂Fluo-3/AM染色,以荧光强度(FI)来代表[Ca²⁺]_i,应用激光扫描共聚焦显微技术动态监测FI的变化。结果 在静息状态下,10μmol·L^-1氧化苦参碱对[Ca²⁺]_i无明显影响;但10μmol·L^-1氧化苦参碱对60mmol·L^-1KCl介导的外钙内流却有明显抑制作用(P<0.05)。结论 氧化苦参碱对电压依赖性钙通道(VDC)具有明显抑制作用,这可能是其抗心律失常作用机制之一。     

卡托普利对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞游离钙和钠钙交换电流的影响

 目的观察卡托普利预处理对缺氧复氧乳鼠心室肌细胞游离钙和钠钙交换电流(Na⁺/Ca²⁺exchange current,I_Na-Ca)的影响。方法建立培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。Flou-3/AM负载染色,应用流式细胞分析技术,测定细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]_i);利用全细胞膜片钳技术,观察I_Na-Ca的变化。结果与正常对照组比较,缺氧复氧可显著增加[Ca²⁺]_i和I_Na-Ca。与缺氧复氧组比较,卡托普利呈浓度依赖性抑制缺氧复氧时[Ca²⁺]_i增加,减少I_Na-Ca的增加。但[Ca²⁺]_i和I_Na-Ca仍高于正常对照组。结论心肌细胞缺氧复氧可引起[Ca²⁺]_i的异常升高,与I_Na-Ca的异常增加有关;卡托普利预处理可能通过轻度增加I_Na-Ca及其[Ca²⁺]_i而触发心脏延迟保护作用,抑制后续缺氧复氧引起的I_Na-Ca及其[Ca²⁺]_i的异常增加。     

As2O3对人骨肉瘤细胞的体外效应

 目的研究三氧化二砷(As₂O₃)对人骨肉瘤细胞U20S的生物学效应及其机制。方法利用MTT法观察As₂O₃对U20S 细胞的生长抑制作用;Annexin V-FTTC+PI双参数检测细胞凋亡;流式细胞仪测定经不同浓度As₂O₃处理后U20S细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡相关蛋白Fas和Bcl-2阳性细胞百分率及细胞内钙离子(IECa²⁺)含量变化。结果As₂O₃可显著抑制U20S细胞生长,且剂量-效应和时间-效应关系显著(P<0.05),其24,钙和72 h的IC₅₀值分别为10.66,2.43和0.46 μmol·L^-1。U20S细胞经As₂O₃处理后可发生凋亡。As₂O₃能显著增加Fas蛋白表达和IECa²⁺含量(P<0.01),下调PCNA蛋白表达(P<0.01),对Bcl-2表达无影响(P>0.05)。结论As₂O₃在体外可显著抑制人骨肉瘤细胞U20S生长并引起凋亡,其机制可能与上调Fas表达和IECa²⁺含量及降低PCNA蛋白表达有关。     

As2O3 不同给药方式对 NB4 细胞侵袭力和 MMPs 活性的影响

 目的 对比 As₂O₃ 不同干预方式对白血病细胞株 NB4 的侵袭力和基质金属蛋白酶 2,9(MMP-2 、 MMP-9) 活性的影响。 方法 噻唑蓝（ MTT ）法检测 As₂O₃ 恒定和变化两种体系体外干预对 NB4 细胞的增殖抑制, ELISA 检测 2 种体系中处理的 NB4 细胞的 MMP-2 和 MMP-9 蛋白含量的变化。明胶酶谱法检测 2 种 As₂O₃ 处理前后 NB4 细胞 MMP-2 活性变化, Westen blot 检测活性 MMP-9 蛋白表达, Transwell 小室穿透实验检测两种 As₂O₃ 处理方式对 NB4 细胞穿透力的影响。 结果 ①与平行对照组比较 0.1 μmol·L^-1 As₂O₃ 恒定浓度体系中持续作用 72 h ,对 MMP-2 、 MMP-9 的活性和 NB4 细胞侵袭力影响不显著。 0.5 μmol·L^-1 As₂O₃ 持续作用 24 h 与对照组比较无明显差异, 48 h 以后 MMP-2 、 MMP-9 的活性和 NB4 侵袭力降低,与对照组比较差异显著。 1.0 μmol·L^-1 以上浓度 As₂O₃ 处理 24 h , MMP-2 、 MMP-9 活性和 NB4 细胞侵袭力下降,并呈时间依赖性。② 2.0 μmol·L^-1 As₂O₃ 恒定浓度体系与峰浓度为 5.0 μmol·L^-1 ,终质量浓度为 0 μmol·L^-1 的变化浓度体系比较,前者对 NB4 的侵袭力和 MMPs 活性的抑制程度比后者更显著。 结论 NB4 细胞的侵袭力与其 MMP-2 、 MMP-9 活性有关,促分化有效的低浓度 As₂O₃ 对 NB4 细胞侵袭力和 MMP-2 、 MMP-9 活性抑制作用不明显。在干预时间相同的情况下,促凋亡有效的恒定浓度 As₂O₃ 持续作用,对 NB4 细胞侵袭力和 MMP-2 、 MMP-9 活性的抑制强度大于峰浓度很高但持续时间很短的变化浓度体系 , 这可能是临床上 As₂O₃ 持续缓慢输注法较常规给药法更能有效降低急性早幼粒细胞白血病（ APL ）中枢神经系统浸润和早期的致死性脑出血发生率的机制之一。     

海嘧啶体内外抗肿瘤作用研究

 目的研究海嘧啶抗胃癌作用及作用机制。方法采用MTT实验和集落形成实验观察海嘧啶的体外抗肿瘤作用;通过 海嘧啶对Fc小鼠和S₁₈₀,H₂₂荷瘤小鼠瘤重和生存时间的研究,观察海嘧啶的体内抗肿瘤作用。采用流式细胞仪测定海嘧啶对 人胃癌细胞凋亡及细胞周期的影响;采用激光扫描共聚焦技术观测海嘧啶对人胃癌细胞内[Ca²⁺]_i的影响及[Ca²⁺]_i变化时Ca²⁺的来源。结果 海嘧啶对8种人癌细胞具有一定的杀伤作用,其中以对BGC-823,Eca-109,HCT-8细胞的抑制作用最强;对 BGC-823,Eca-109,HCT-8细胞的集落形成有明显的抑制作用,并以对Eca-109细胞集落形成抑制作用最强;可明显抑制FC小鼠 和S₁₈₀小鼠瘤体的生长,明显延长H₂₂荷瘤小鼠的生存时间。海嘧啶可诱导肿瘤细胞凋亡,升高肿瘤细胞内[Ca²⁺]_i的浓度, [Ca²⁺]_i升高时Ca²⁺来源于细胞外钙内流和细胞内钙释放。结论海嘧啶有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤机制为诱导肿瘤细 胞凋亡。海嘧啶通过开放细胞膜钙通道和引起细胞内钙释放两条途径升高肿瘤细胞内[Ca²⁺]_i,启动细胞凋亡机制,从而诱导 肿瘤细胞凋亡。     

三氧化二砷对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响

 目的 研究三氧化二砷(As₂O₃)对豚鼠心室肌细胞内游离钙离子浓度的影响。方法Fluo-3／AM荧光探针标记豚鼠心室肌细胞游离钙离子,激光共聚焦显微镜实时测定不同浓度As₂O₃干预5 min后心室肌细胞的胞浆钙的变化。不同剂量的As₂O₃对正常台氏液中的豚鼠心肌细胞体外浓度递减性干预13 h后心肌细胞DNA片断化的情况。结果 不同浓度As₂O₃对心室肌细胞的胞浆钙影响不同。在正常台氏液中,低浓度As₂O₃引起一过性钙增高,高浓度的As₂O₃引起持续钙增高,并被钙通道阻滞剂维拉帕米不完全阻断。在无钙台氏液中,低浓度As₂O₃对胞浆钙无影响,高浓度的As₂O₃引起持续钙增高。10μmol·L^-1的As₂O₃体外浓度递减性干预13 h后,豚鼠心肌细胞发生DNA的片断化。低于10μmol·L^-1的As₂O₃体外浓度递减性干预13 h后,心肌细胞无明显的DNA片断化。结论 As₂O₃影响细胞外钙内流和细胞内钙库释放,导致心肌细胞内的游离钙升高,其机制可能有电压依赖性钙通道参与。低浓度引起胞内一过性钙升高;高浓度导致胞内持续性钙升高。后者可能是As₂O₃诱导细胞凋亡的机制之一。     

冬虫夏草对豚鼠心室肌细胞胞浆钙离子浓度及L-型钙电流的影响

目的　研究冬虫夏草 (Codycepssinensis,CS)水提液对豚鼠单个心室肌细胞胞浆内钙离子浓度 ([Ca2 ]i)及L 型钙电流 (ICa L)的影响。方法　酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞 ,应用激光扫描共聚焦显微镜联合全细胞膜片钳技术测定豚鼠心室肌细胞 [Ca2 ]i以及ICa L的变化。结果　应用 0 1mg/mL (生药浓度 )冬虫夏草水提液 ,在静息状态下对 [Ca2 ]i 无影响 ;对 6 0mmol/LKCl诱导的胞浆 [Ca2 ]i升高有促进作用 ,峰值荧光强度在 12 0s时由12 0 4 3± 2 38 4增加至 185 5 2± 32 1 0 (n =6 ,P <0 0 5 )。膜片钳研究结果表明 ,冬虫夏草水提液可明显促进ICa L,使ICa L从 (- 15 1± 2 3)pA/ pF增加到 (- 19 7± 3 2 ) pA/pF (刺激电压为 10mV ,n =8,P <0 0 1)。 结论　冬虫夏草水提液促进心肌细胞钙内流 ,是该药治疗缓慢型心律失常的机制之一。     

Effects of Total Flavones from Acanthopanax senticosus on L‐type Calcium Channels,Calcium Transient and Contractility in Rat Ventricular Myocytes

Acanthopanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms (AS), a traditional herbal medicine, has been widely used to treat ischemic heart disease. However, the underlying cellular mechanisms of its benefits to cardiac function remain unclear. The present study examined the effects of total flavones from AS (TFAS) on L‐type Ca²⁺ channel currents (I_Ca‐L) using the whole cell patch‐clamp technique and on intracellular calcium ([Ca²⁺]_i) handling and cell contractility in rat ventricular myocytes with the aid of a video‐based edge‐detection system. Exposure to TFAS resulted in a concentration‐ and voltage‐dependent blockade of I_Ca‐L, with the half‐maximal inhibitory concentration (IC₅₀) of 283.12 µg/mL and the maximal inhibitory effect of 36.49 ± 1.95%. Moreover, TFAS not only increased the maximum current in the current–voltage relationship but also shifted the activation and inactivation curves of I_Ca‐L toward the hyperpolarizing direction. Meanwhile, TFAS significantly reduced amplitudes of myocyte shortening and [Ca²⁺]_i with an increase in the time to 10% of the peak (Tp) and a decrease in the time to 10% of the baseline (Tr). Thus, the cardioprotective effects of TFAS may be attributed mainly to the attenuation of [Ca²⁺]_i through the direct inhibition of I_Ca‐L in rat ventricular myocytes and consequent negative effect on myocardial contractility. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

Puerarin attenuates glutamate-induced neurofilament axonal transport impairment

Aim of the study

Puerarin (Pur) is a primary component of the most functional extracts of Pueraria lobata used in traditional Chinese medicine for centuries. Since it has been postulated that Pur protects the brain against glutamate (Glu) neurotoxicity, we investigated the effects of Pur on Glu-induced axonal transport impairment in primary hippocampal neurons in this study.

Materials and methods

Primary hippocampal cultures were prepared from 2-day-old Sprague-Dawley rats. Intracellular calcium concentration [Ca²⁺]_i, neurofilament (NF) phosphorylation and protein kinase activity for Cdk5 were measured. Time-lapse imaging technology was used to capture the NF axonal transport in the cultured neurons with transiently transfected fluorescence protein linked to the N-terminus of NF-M (EGFP-NFM).

Results

The results showed that Pur significantly diminished the Glu-induced elevation of [Ca²⁺]_i in dose-dependent manner and antagonized the Glu-evoked increases in NF phosphorylation at protein levels. The neurons under the Glu treatment displayed the accumulation of immobile NF clusters in the cell body and the reduced rates of axonal transport of NFs by 72.8% compared to the control neurons. Intriguingly, Pur reversed the slowed rate of the axonal transport by 35.6%. Pur also remarkably attenuated Glu-evoked activation of Cdk5.

Conclusions

Pur may play a role in protecting against Glu-induced NF axonal transport impairment in rat primary hippocampal neurons by inhibiting the increased [Ca²⁺]_i and by impeding the activation of Cdk5.