AIF多克隆抗体的制备纯化和鉴定

目的制备抗AIF多克隆抗体。方法用人工合成的AIF抗原肽免疫实验动物制备多克隆抗体并纯化。利用ELISA和Western blot方法检测多克隆抗体的效价和特异性。结果实验获得的血清抗AIF抗体经间接ELISA法检测,效价达到1∶128 000。Western blot检测表明抗体效价高、特异性强。结论实验获得了高效价的特异性的抗AIF抗体,为进一步研究肿瘤的抗凋亡机制提供新的方法。     

肝癌相关基因HTA的重组表达及多克隆抗体的制备

目的将肝癌相关基因HTA进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其作为肝癌导向治疗靶点的可行性及临床意义奠定基础。方法应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到HTA3＋cDNA,再将其克隆到原核表达载体pET21a（＋）-MBP内,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白MBP-HTA,通过Westernblot和ELISA方法检测重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体,并采用ELISA、Westernblot和免疫组化的方法检测抗体的灵敏度和特异性。结果成功地构建了表达MBP-HTA融合蛋白的原核表达质粒pET21a（＋）-MBP-HTA。重组MBP-HTA融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）内得以高效表达,且以包涵体的形式存在。His-tag磁珠纯化试剂盒纯化和Westernblot分析,得到了分子量约为52kDa的目的蛋白。获得了高效价的特异性多克隆抗体,经ELISA检测抗体的效价为1：3200。用Westernblot检测的效价为1：400。免疫组织化学检测表明：肝癌组织中HTA蛋白的阳性表达率明显高于正常肝组织俨〈0．01）。结论成功地制备出抗MBP-HTA多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性;能用于免疫组织化学的检测,且HTA在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织。HTA蛋白有望成为肝癌导向治疗的潜在靶点。     

重组人sCR1多克隆抗体制备及纯化鉴定

目的制备原核表达人sCR1多克隆抗体并对其进行鉴定。方法提取人总RNA进行RT-PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a-sCR1。在大肠杆菌中表达人sCR1融合蛋白作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,免疫亲和层析法纯化后,进行SDS-PAGE鉴定分析。结果sCR1表达融合蛋白免疫家兔制备的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1融合蛋白。结论纯化复性后的sCR1融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,并有较高的效价及特异性。为进一步大量表达纯化及临床免疫学检测方法的键立奠定了基础。     

抗α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的制备、纯化和鉴定

目的 用α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)免疫家兔以产生多克隆抗体,并对产生的抗体进行有效地纯化和效价鉴定,建立抗α1-AT多克隆抗体的生产工艺.方法 按照常规方法免疫健康家兔进行抗α1-AT多克隆抗体的制备,用ELISA检测血清抗体效价.处死抗血清效价合格的家兔,取血、离心,获取抗血清.联合应用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法对抗血清进行纯化,纯化的多克隆抗体经15%十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度后,用ELISA测定效价.结果 ELISA检测表明,家兔产生的抗α1-AT多克隆抗体效价大于105.联合应用辛酸-硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析法进行纯化获得了纯度高、活性好的抗α1-ATT多克隆抗体.结论 成功建立了抗α1-AT多克隆抗体的生产和纯化工艺.     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备

目的实现纳豆激酶(NK)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,以纯化产物为抗原制备兔抗NK血清。为建立双抗夹心酶联免疫吸附反应法测定生物体内NK含量,进一步研究NK在体内代谢与功能奠定基础。方法将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,鉴定后的重组质粒用SalⅠ酶切线性化后电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中,甲醇诱导表达,经盐析和Millipore超滤膜过滤分离纯化表达产物。纤维蛋白法检测纯化产物的活性,并以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔制备兔抗NK血清。结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达,其相对分子质量(Mr)约为27 000,纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性。酶联免疫法测得多克隆抗体效价约为1∶8 000,Western blot结果显示在Mr27 000附近有1条特异带出现。结论NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性。     

Fas基因在心肌梗塞病人心肌细胞中的表达

为探讨心肌梗塞(心梗)心肌细胞中促凋亡基因Fas表达及其意义,采用免疫组织化学方法(SABC法)检测了42例心肌梗塞心肌细胞及12例正常心脏F雒表达和定位。结果发现,Fas表达在急性心梗为15.4%,陈旧性心梗为56.1%,正常对照组16.6%。陈旧心梗瘢痕边缘带弥漫分布Fas过度表达、陈旧心梗合并充血性心衰者多见Fas表达。结论:存活心肌对抗慢性缺血、瘢痕形成心肌顺应性下降而诱发Fas表达,激活细胞凋亡机制。细胞凋亡发生后心肌细胞数量明显减少,引起和加重了充血性心衰。     

Ⅳ型胶原多克隆抗体的制备及性质研究

目的通过免疫母鸡制备抗人Ⅳ型胶原多克隆抗体（IgY）,为检测人血清Ⅳ型胶原含量提供IgY。方法采用人胎盘来源的Ⅳ型胶原蛋白作为抗原,免疫Leghorn母鸡,采用PEG方法分离纯化鸡卵黄中的抗体,获得抗体粗提物。经SephadexG100凝胶过滤制备多克隆抗体纯品。使用SDS—PAGE、免疫琼脂双向扩散等方法对提取物的含量、纯度及特异性进行鉴定。结果电泳结果显示,抗体粗提物纯度为81％。抗体纯品仅在70kd和25kd处各有一条带,纯度达到96％;免疫琼脂双向扩散实验结果显示,抗体纯品、粗品及免疫三周后鸡血清均与中心孔的抗原形成抗原抗体复合物的乳白色沉淀线。结论本研究分离纯化方法制备的抗Ⅳ型胶原IgY,具有抗体纯度高、特异性强等特点,为多克隆抗体广泛应用奠定了基础。     

葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆、表达和纯化

目的构建表达金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)抗体结合区基因SPA-ZZ的pET-32a-ZZ表达载体,在大肠杆菌BL21中进行高效表达并初步纯化。方法用PCR从pEZZ18中克隆SPA抗体结合区基因ZZ,构建重组表达质粒pET32-ZZ,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,IPTG诱导表达,表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE),并用Q-Sephrose Fast Flow柱进行初步纯化。结果得到了高效表达SPA-ZZ的pET32-ZZ表达载体,表达产物经SDS-PAGE检测相对分子质量为41 000,初步纯化后可得到较纯的表达蛋白。结论SPA抗体结合区蛋白ZZ能在大肠杆菌中高效表达,为SPA-ZZ的应用奠定了一定的基础。     

钝顶螺旋藻异藻蓝蛋白多克隆抗体的制备

异藻蓝蛋白（allophycocyanin,APC）是螺旋藻细胞中的主要蛋白成分之一,具有多种生理功能和广阔应用前景。本研究采用纯化的钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）APC为抗原,免疫新西兰兔,制备APC的多克隆抗体。 ELISA法提示制备的抗体效价高达1∶32000, western blot印迹法确定获得的抗体能与APC产生特异性免疫反应。这为今后进一步开展螺旋藻APC的相关研究提供了有力的工具。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

黄芩苷完全抗原的合成鉴定及其多克隆抗体的制备

目的:研究黄芩苷作为一种半抗原分子,通过与载体蛋白偶联形成完全抗原后,使免疫动物血清中产生特异性抗体的可能性,为进一步建立黄芩苷的免疫分析测定方法提供实验依据。方法:采用活性酯法将黄芩苷(BAL)与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备黄芩苷完全抗原(BAL-BSA),并采用红外吸收光谱法、SDS-PAGE法、MALDI-TOF-MS法对其进行鉴定。用此完全抗原免疫动物制备抗血清,通过间接ELISA法检测其抗体效价。结果:完全抗原BAL-BSA中BAL与BSA的偶联比为3∶1;用此完全抗原免疫的家兔产生针对BAL的多克隆抗体,抗体效价最高可达1∶8000。结论:成功合成了BAL的完全抗原BAL-BSA,且该抗原具有良好的反应原性与免疫原性。     

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达CYP1A1（第241-381个氨基酸）与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合蛋白作为抗原,用于制备CYP1A1多克隆抗体. 根据正反重组质粒pGEX/1A1表达的融合蛋白大小不同的原理,直接表达筛选得到正向重组质粒pGEX/1A1. 通过优化表达条件, 提高了目的蛋白的表达水平. 包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离, 获含纯化融合蛋白GST-1A1的PAGE凝胶. 直接用含GST-1A1的凝胶悬液免疫BALB/c小鼠,自腹水中获取CYP1A1多克隆抗体（1A1pAb）. 1A1pAb用切胶纯化的融合蛋白GST-2B6交叉吸收,蛋白A- Sepharose亲和层析柱来纯化. 用切胶纯化的融合蛋白GST-1A1及GST-2B6的免疫印迹反应初步鉴定1A1pAb的特异性. 纯化的1A1pAb对融合蛋白GST-1A1反应特异性较强,但仍对GST-2B6有弱交叉反应. 在实际应用中可根据反应强度来加以区分.     

人细胞色素P450 1A1与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白及其抗体的制备

采用融合蛋白技术原核表达 CYP1 A1 (第 2 4 1- 381个氨基酸 )与谷胱甘肽 S-转移酶 (GST)的融合蛋白作为抗原 ,用于制备 CYP1 A1多克隆抗体 .根据正反重组质粒 p GEX/ 1 A1表达的融合蛋白大小不同的原理 ,直接表达筛选得到正向重组质粒p GEX/ 1 A1 .通过优化表达条件 ,提高了目的蛋白的表达水平 .包涵体蛋白经制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分离 ,获含纯化融合蛋白 GST- 1 A1的 PAGE凝胶 .直接用含 GST- 1 A1的凝胶悬液免疫 BALB/ c小鼠 ,自腹水中获取 CYP1 A1多克隆抗体 (1 A1 p Ab) . 1 A1 p Ab用切胶纯化的融合蛋白GST- 2 B6交叉吸收 ,蛋白 A- Sepharose亲和层析柱来纯化 .用切胶纯化的融合蛋白 GST- 1 A1及 GST-2 B6的免疫印迹反应初步鉴定 1 A1 p Ab的特异性 .纯化的 1 A1 p Ab对融合蛋白 GST- 1 A1反应特异性较强 ,但仍对 GST- 2 B6有弱交叉反应 .在实际应用中可根据反应强度来加以区分     

氨茶碱对体外嗜酸性粒细胞凋亡及Fas mRNA表达的影响

目的　通过观察氨茶碱对体外不同密度嗜酸性粒细胞 (Eos)凋亡及FasmRNA表达的影响 ,探讨其促进哮喘Eos凋亡的机制。方法　卵蛋白激发哮喘豚鼠动物模型 4 8h后行支气管肺泡灌洗 ,分离不同密度Eos。氨茶碱 (AM )( 10 -6 ～ 10 -3mol·L-1)干预 2 4h ,原位杂交检测Eos的FasmRNA表达 ,TUNEL法检测细胞凋亡。结果　AM干预 2 4h ,可见Eos凋亡增加 ,以低密度Eos(HEos)为明显 ,与不加药物相比 ,在 10 -5mol·L-1时差异有显著性 (P <0 0 5 ) ,FasmRNA表达降低 ,呈剂量依赖性 ,HEos与正常密度 (NEos)相比 ,其FasmRNA表达无差别。FasmRNA的表达与Eos凋亡呈正相关。结论　AM可提高FasmRNA表达 ,促进Eos凋亡。Fas可能是AM调节Eos凋亡的通路之一。