生存素反义寡核苷酸对胃癌细胞的抑制作用

目的研究生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞系HS746T的抑制作用。方法应用SurvivinASODN转染胃癌细胞,设空白、脂质体和正义链对照组,100、200和400nmol/L反义链组。电镜下观察细胞超微结构,流质细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Westernblot法检测转染后2～48h细胞凋亡指数(AI),生长抑制率(IR),SurvivinmRNA和蛋白表达的变化。结果转染后反义链组均能够下调SurvivinmRNA含量和蛋白表达,凋亡细胞增多。转染后24h100、200和400nmol/L反义链组AI为14.8%、19.4%及53.8%;IR(%)为45.98±2.99、50.96±3.38、72.79±2.48,反义链组高于其他对照组。结论Survivin反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞增殖。     

反义Survivin对人结肠癌细胞凋亡及耐药性的影响

目的 观察Survivin ASODN联合长春新碱（VCR）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）对人结肠癌细胞系HT-29凋亡的影响。方法 设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸（ASODN）。HT-29细胞分成6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、100、200、300nmol／L反义链转染组。以阳离子脂质体为载体转染至HT-29细胞内，用Westernblot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；MTT法检测VCR、5-Fu对转染前后细胞的生长抑制情况。结果各浓度ASODN转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少，而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化。各ASODN转染组VCR、5-Fu对肿瘤细胞生长抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），且300nmol／L转染组明显高于100和200nmol／L组（P〈0．05）。ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05），以300nmol／L转染组加VCR作用后凋亡指数最高（P〈0．01）。结论Survivin ASODN转染人结肠癌细胞能下调Survivin蛋白的表达，诱导结肠癌细胞凋亡，抑制细胞增值，增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

陷阱受体3反义寡核苷酸对胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的 观察陷阱受体3(DcR3)反义核苷酸(ASODN)在胶质瘤细胞凋亡中的作用.方法 构建并挑选DcR3反义核苷酸,转染U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法 观察DcR3 mRNA和蛋白有无降低,流式细胞仪观察细胞凋亡的变化.结果 经1.2 μmol/L AS20DN处理的U251细胞可有效地降低DcR3 mRNA和蛋白表达,DcR3/β-actin比值分别为(12.4±3.1)%和(13.5±4.2)%,错义链组、脂质体组、对照组mRNA和蛋白分别为(68.8±4.5)%、(74.5±5.0)%、(71.3±6.4)%和(78.2±6.8)%、(79.8±4.5)%、(76.4±5.6)%,差异有统计学意义(P＜0.05),同时,传染DcR3反义核苷酸的U251细胞凋亡率为(42.9±13.1)%,明显高于错义链组(15.8±4.8)%、脂质体组(15.7±3.7)%和对照组(14.6±4.0)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DcR3反义核苷酸可使U251细胞凋亡增多.     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞的抑制作用

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对骨肉瘤细胞的抑制作用。方法设计合成VEGF ASODN,按不同浓度转染骨肉瘤OS-732细胞,设正义(SODN)和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态,Western blot检测VEGF蛋白表达,MTT法测定细胞生长抑制率(IR),流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与SODN、对照组比较,ASODN组细胞中VEGF表达显著降低(P<0.05),IR(分别为10μmol/L组34.21%,20μmol/L组39.50%)显著增高(P< 0.05),上述效应呈浓度依赖性;镜下观察ASODN转染细胞代谢衰退,当转染浓度至20μmol/L时,其凋亡率AI值(18.25±0.40)%显著高于对照组(5.20±0.28)%和SODN组[(6.41±0.10)%, P<0.01]。结论ASODN能够特异性封闭骨肉瘤细胞VEGF基因表达;并可抑制细胞增殖,诱导其凋亡。     

脂质体生存素反义寡核苷酸抑制胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的作用

目的探讨脂质体生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及机理。方法将24只裸鼠建立人胃癌细胞系HS-746T皮下移植瘤模型,用不同的转染液处理后随机分成6组：空白对照组,脂质体组,正义链组,100、200和400nmol／L反义链组(ASODN组)。于注射相应试剂后2,4,8,12,16,20d观测裸鼠移植瘤体积,计算抑瘤率和肿瘤缩小率,观察移植瘤细胞形态变化,免疫组化SP法检测生存素的表达,并用逆转录聚合酶链反应技术(RT—PCR)和Western blot蛋白免疫印迹法比较治疗后不同时间各组肿瘤组织中生存素mRNA和蛋白表达的变化。结果注射后20d空白组、脂质体组和正义链组裸鼠的抑瘤率无明显差异,而ASODN组移植瘤的体积随着时间和浓度的增加而减小,肿瘤缩小率则增大,抑瘤率均大于对照组,400nmol／LASODN组抑瘤率最大为93％。光镜下见ASODN组移植瘤凋亡细胞数增多,生存素表达减弱,6例(6／12)肿瘤组织有坏死液化灶。各ASODN组均能够下调移植瘤细胞生存素mRNA含量,抑制生存素蛋白表达,注射20d后400nmol／L ASODN组蛋白表达为空白对照组的36．8％。结论生存素基因反义寡核苷酸能够通过诱导人胃癌裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡,下调生存素mRNA和蛋白的表达,抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。     

反义寡核苷酸抑制Survivin基因表达对PC-3的体外作用

目的　观察Survivin反义寡核苷酸 (ASODN)PC 3细胞表达Survivin蛋白、细胞凋亡、增殖的影响。方法　设计并合成特异性靶向Survivin的ASODN。PC 3分为 6组 :空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN转染组。作用 2 4h后收获各组细胞。观察细胞形态变化及超微结构变化 ,免疫组织化学法和流式细胞术法检测各组细胞Sur vivin表达情况 ,流式细胞术检测各组细胞增殖指数 (AI)和凋亡指数 (PI) ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测ASODN对细胞的生长抑制率。结果　电镜下可见到典型凋亡样改变 ;各ASODN转染组细胞Survivin表达有不同程度减弱 ;2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN转染组AI和PI分别为 (8.5 0±0 .79) % ,(13 .78± 0 .5 6) % ,(2 1.3 1± 1.67) %和 (3 7.80± 1.72 ) % ,(2 5 .10± 2 .18) % ,(19.90±0 .97) % ,分别与对照组相比差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而AI和PI在各对照组间差异无显著性(P >0 .0 5 )。转染后第 3天 2 0 0、40 0和 60 0nmol/LASODN组相对于空白对照组的抑制率分别为60 .0 %、66.0 %、78.6%。结论　SurvivinASODN转染后能下调Survivin蛋白表达 ,诱导PC 3细胞凋亡 ,抑制PC 3细胞增殖。     

α1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸转染人瘢痕成纤维细胞的条件优化

目的优化α1(I)型前胶原基因反义寡核苷酸(ASODN)转染人增生性瘢痕成纤维细胞的条件.方法 ASODN经FITC标记,以阳离子脂质体Oligofectamine为载体转染体外培养的第2～6代人增生性瘢痕成纤维细胞,转染后24 h激光共聚焦显微镜下记录荧光素的细胞内分布;流式细胞术计数荧光细胞百分率、作细胞凋亡分析,以荧光细胞百分率最高者为最佳转染效率,依次筛选细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体量.结果 (1)脂质体转染ASODN,所用各转染条件未引起成纤维细胞凋亡;转染后细胞浆和细胞核内均有荧光素聚集.(2)接种细胞数量为14.25×104个/孔的荧光细胞百分率为74.0%,接种数量为30.00×104个/孔的为73.3%,接种数量为32.25×104个/孔的为94.3%,接种数量为39.00×104个/孔的为64.2%.(3)转染液中ASODN浓度100 nmol/L,荧光细胞百分率为38.1%;150 nmol/L时,为62.6%;200 nmol/L时49.5%;250 nmol/L时35.8%.(4)转染所用的脂质体量2 μl时,荧光细胞百分率为77.01%,3 μl时85.05%,4 μl为71.64%.结论α1(I)型前胶原基因ASODN脂质体转染人增生性瘢痕成纤维细胞的最佳转染条件为接种细胞数量32.25×104个/孔,反义核酸浓度150 nmol/L,脂质体3 μl/孔.通过优化转染条件可提高转染效率,为下一步设计药物开发研究提供基础.     

过氧化物酶体增殖物激活受体β反义寡脱氧核苷酸促进肿瘤坏死因子α介导的HaCaT细胞凋亡的实验研究

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β反义寡脱氧核苷酸(asODN)在肿瘤坏死因子(TNF)α介导的HaCa了细胞凋亡中的作用。方法常规复苏HaCaT细胞,随机分为正常对照组(不行转染)、对照组(单纯用脂质体处理)、错义寡脱氧核苷酸(scrODN)组(转染PPARβscrODN)、asODN组(转染PPARβasODN)、TNF-α组(受TNF-α刺激)、scrODN TNF-αC组(同scrODN组处理后受TNF-α(刺激)、asODN TNF-α组(同asODN组处理后受TNF-αC刺激),PPARβscrODN或asODN均为4μmol／L,TNF-α为10μg／L。采用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法观察PPARβmRNA及其蛋白质的表达水平;采用hoechst33258荧光染色,观察细胞的形态学改变并计算凋亡核百分率;采用噻唑蓝法测定存活细胞数;采用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)比色测定试剂盒检测caspase-3的活化情况。结果正常对照组、对照组、scrODN组PPARβmRNA及其蛋白质的表达水平相近;asODN组则明显下降。正常对照组、scrODN组及asODN组凋亡核百分率低下,存活细胞数较多,caspase-3活性也处于低水平。TNF-α组、scrOON TNF-α组凋亡核百分率分别为(33．1±2．7)％、(32．9±3．0)％,存活细胞数较少,caspase-3活性较高;asODN TNF-α组凋亡核百分率增至(58．8±4.6)％,且存活细胞数、caspase-3活性分别明显低于和高于前2组(P<0．05)。结论PPARβasODN能促进TNF-α介导的HaCaT细胞凋亡。     

核因子-кB/p65反义寡核苷酸对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的 观察核因子(NF)-кB/p65反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计合成NF-кB/p65 ASODN,按照0.05、0.1、0.2.0.3、0.4、0.5 μmol/L不同浓度转染胃癌SGC-7901细胞株,设正义寡核苷酸(SODN)、错义寡核苷酸(MSODN)和空白对照组进行比较.利用荧光染色观察转染效果,噻唑蓝(M1T)比色法检测细胞生长抑制率(IR),流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况.结果 与SODN、MSODN及对照组比较,ASODN组细胞增殖明显受到抑制(P<0.05),72 hIR为58.3%,且这种抑制作用呈浓度依赖性.FCM结果显示ASODN可诱导细胞的凋亡.结论 NF-кB ASODN能抑制胃癌细胞生长,其机制与ASODN诱导的细胞凋亡有关,NF-кB可作为胃癌治疗的新靶点.     

干扰X连锁凋亡抑制蛋白基因对人胆管癌QBC939细胞增殖及凋亡的作用

目的 观察反义寡核苷酸(ASODN)对人胆管癌QBC939细胞株X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因的抑制作用及对癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 脂质体法将ASODN转染入QBC939细胞中,转染12、24、48 h后荧光显微镜观察转染后细胞状态及转染率,应用噻唑蓝(MTT)比色法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和流式细胞仪法测定1.11μmol/L时细胞生长抑制率、XIAP mRNA表达和细胞周期及凋亡率.结果 转染效率可达95%;与对照组比较,1.11μumol/L细胞抑制率为(27.63±1.15)%(24 h),(42.95±1.07)%(48 h);mRNA下调23%(P<0.05);G_0/G_1期细胞、凋亡率高于对照组约27.34%、9.94%(P<0.05).结论 ASODN能有效下调QBC939细胞XIAP基因表达,抑制细胞增殖并诱导凋亡.     

干扰Livin基因对人胆管癌QBC939细胞增殖影响的研究

目的 研究转染Livin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人胆管癌细胞株QBC939细胞Livin mRNA及Livin蛋白表达以及细胞增殖的影响.方法 设计合成全硫代磷酸化修饰并5'端FITC荧光标记的Livin ASODN.用脂质体介导Livin ASODN转染QBC939细胞,荧光显微镜观察24 h Livin ASODN转染人细胞的情况,并计算转染率.MTT法检测Livin反义寡核苷酸对QBC939细胞增殖的抑制作用.RT-PCR和细胞免疫荧光化学分别检测转染后48 h Livin mRNA表达及Livin蛋白的变化.结果 500 mol/L ASODN转染后24 h可达到最佳的转染效果;转染后60 h,能明显抑制胆管癌细胞的增殖.转染60 h后,RT-PCR及细胞免疫荧光化学检测分别显示Livin mRNA及Livin蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05).结论 脂质体介导转染Livin ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的Livin基因及Livin蛋白表达,抑制胆管癌QBC939细胞的增殖,降低癌细胞活力.

Abstract：

Objective To study the effect of transfection of livin antisense oligodeoxynucleotide (Livin ASODN) on Livin mRNA and Livin protein expression and proliferation of QBC939 cells.Methods Livin ASODN was transfected into cell line QBC939 by LipofectamineTM 2000. Fluorescence microscopy was used to observe the ASODN transfected cells and to calculate the rate of transfection.to measure Livin mRNA and Livin protein expression by RT-PCR and immunohistochemistry and con-focal laser scanning microscopy after the transfection. Changes in cell proliferation were detected by MTT. Results The highest efficiency was at 24 hours after 500 nmol/L Livin ASODN transfection.The results of MTT showed that the inhibition of cell proliferation of QBC939 cells was most obvious at 60 hours after Livin ASODN transfection (P<0. 05). The level of Livin mRNA and Livin protein expression in the ASODN group was obviously lower than that in the control group (P<0. 05).Conclusion The transfection of Livin ASODN inhibited Livin gene and Livin protein expression, and obviously inhibited the proliferation and depressed the vitality of QBC939 cells.     

pEGFP-Survivin对GBC-SD细胞生长的抑制及对化疗敏感性的影响

目的 观察重组质粒pEGFP-Survivin对胆囊癌细胞(GBC-SD)化疗敏感性的影响.方法 以噻唑蓝(MTT)比色法检测GBC-SD、GBC-SD/EGFP和GBC-SD/Survivin 3种细胞的增殖活性;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot测各组细胞中Survivin mRNA和蛋白质水平的表达;以合适浓度的顺铂(DDP,3.0 ms/L)作用相同的时间后,用MTY法检测3种细胞存活率,流式细胞仪测细胞凋亡,并用MIT法筛选IC_(50)值,TUNEL法观察细胞核改变;另外检测DDP作用后各组细胞的Caspase-3蛋白酶活性的变化.结果 GBC-SD和GBC-SD/EGFP细胞的增殖活性大致相同,而GBC-SD/Survivin细胞的增殖活性明显下降;RT-PCR和Western blot均发现GBC-SD/Survivin细胞中的Survivin表达水平较其余两种细胞明显下降(分别下降了74.7%和71.5%);在给予了DDP作用后,GBC-SD/Survivin细胞存活率和IC_(50)[(2.03±0.24)ms/L]明显较低,细胞凋亡率较高(84.3%),而3种细胞用TUNEL法染色后均可见棕色凋亡细胞核.给予了DDP作用后,各组细胞Caspase-3活性均呈现先升高后下降的趋势,但GBC-SD/Survivin细胞中Caspase-3的活性明显高于另外两种细胞.结论 pEGFP-Survivin表达的Survivin shRNA能明显降低GBC-sD细胞中Survivin的表达,提高对化疗药物的敏感性.     

胰高血糖素样肽1对骨骼肌成肌细胞增殖的调控及信号机制

目的 探讨胰高血糖素样肽l( GLP-1)对骨骼肌成肌细胞增殖的调控作用及其信号机制.方法 体外培养大鼠骨骼肌成肌细胞株L6,并按随机数字表法分为4组:(1)对照组,培养液中除常规成分外不再添加其他物质;(2)GLP-1组,培养液中加入终浓度10 nmol/L的GLP-1;(3)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂组,培养液中加人终浓度为50 nmol/L的PI3K特异性抑制剂渥曼青霉素;(4) GLP-1 +PI3K抑制剂组,培养液中加入终浓度10 nmol/L的GLP-1和终浓度50 nmol/L的渥曼青霉素.各组细胞接受上述处理后分别继续培养24、48、72 h,采用噻唑蓝法测定细胞增殖活性(结果用吸光度值表示);继续培养24 h时,用流式细胞仪检测细胞周期分布,行免疫组织化学染色检测细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)表达,蛋白质印迹法检测磷酸化(p-)蛋白激酶B(Akt)、p-PI3K的蛋白表达水平.对实验数据行方差分析.结果 (1) GLP-1组细胞接受处理后48、72 h,增殖活性分别为0 660±0.120、0 870±0 240,均显著高于对照组(0.530±0 060、0.700±0 100,F值分别为5.46、5 90,P ＜0.05或P＜0.01).PI3K抑制剂组各时相点增殖活性均低于对照组.GLP-1+PI3K抑制剂组处理48、72 h,细胞增殖活性分别为0 510±0.080、0 740±0.160,与GLP-1组比较差异均有统计学意义(F值分别为5 46、5 90,P＜0.05或P＜0.01).(2)处理后24 h,GLP-1组S期细胞百分比为(15.7±0.4)％,显著高于对照组[(13.6±0.6)％]和GLP-1+ PI3K抑制剂组[(10 1±0 6)％];PI3K抑制剂组S期细胞百分比为(6 8±1.2)％,明显低于对照组.以上各项比较F值均为15 39,P值均小于0.01.(3)处理后24 h,GLP-1组细胞PCNA增殖指数为(51.24±1 18)％,显著高于对照组[(36.72±1.56)％]和GLP-1+ P13K抑制剂组[(25.90±1.22)％];PI3K抑制剂组PCNA增殖指数为(21.70±0.09)％,明显低于对照组.以上各项比较F值均为783 80,P值均小于0 05.(4)处理后24 h,GLP-1组细胞p-Akt蛋白表达水平显著高于其余3组,PI3K抑制剂组明显低于对照组.以上各项比较F值均为94.43,P值均小于0 01.GLP-1组、GLP-1+ PI3K抑制剂组p-PI3K蛋白表达水平与对照组接近(F值均为20 94,P值均大于0.05),PI3K抑制剂组较对照组明显降低(F=20.94,P ＜0.05).结论 GLP-1可直接作用于骨骼肌成肌细胞,通过加速细胞周期进程,增加DNA合成,促进细胞增殖.该作用与PI3 K/Akt信号途径密切相关.     

靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响

目的研究靶向抑制survivin基因对肝细胞癌血管生成的影响,探讨survivin在血管生成中的作用机制。方法采用脂质体介导survivin ASODN体外转染人肝癌细胞株HepG2,Western blot检测细胞中survivin蛋白的表达;RT-PCR检测细胞中VEGF mRNA的表达;FCM检测细胞的凋亡率;利用皮下注射法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型;采用脂质体包裹survivin ASODN直接瘤内注射,观察其对移植瘤生长情况的影响;SABC法检测移植瘤组织MVD。结果400 nmol/L survivin ASODN转染可明显下调HepG2细胞survivin蛋白表达,但不影响VEGF mRNA表达;ASODN组HepG2细胞凋亡率显著高于空白对照组和SODN组(F=428.19,P<0.01);ASODN组瘤体生长速度较空白对照组和SODN组明显减慢(F=12.63,P<0.01);ASODN组瘤体重量较空白对照组和SODN组明显减轻(F=5.90,P<0.05);ASODN组MVD较空白对照组和SODN组明显降低(F=34.29,P<0.01)。结论survivin ASODN可以抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,其机理可能是诱导HepG2细胞自发性凋亡和抑制肿瘤血管生成。     

反义DcR3寡核苷酸协同顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡

目的 观察陷阱受体3(DcR3)反义核苷酸(ASODN)与顺铂对胶质瘤细胞的影响.方法 设计DcR3反义核苷酸,转染U251细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot方法观察DcR3 mRNA和蛋白有无降低,用噻唑蓝(MTT)比色法、荧光显微镜DAPI染色分别检测对照组、顺铂组、反义核苷酸组、协同作用组对胶质瘤细胞U251的影响.结果 反义DcR3寡核苷酸组可有效地降低DcR3 mRNA和蛋白表达,DcR3/β-actin比值分别为(12.4±3.1)%和(13.5±4.2)%,错义链组、脂质体组、对照组mRNA和蛋白分别为(68.8±4.5)%、(74.5±5.0)%、(71.3±6.4)%和(78.2±6.8)%、(79.8±4.5)%、(76.4±5.6)%,差异有统计学意义(P<0.05).顺铂与反义寡核苷酸组细胞凋亡率分别为(18.32±2.32)%和(20.43±3.45)%,较对照组(5.21±0.45)%,差异有统计学意义(P<0.05),两者与协同处理组(45.23±6.78)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 DcR3反义核苷酸与顺铂协同作用可有较强的促胶质瘤细胞凋亡作用.     

槲皮素联合survivin反义核苷酸对肝癌细胞凋亡协同作用的研究

目的 探讨槲皮素联合survivin反义核苷酸(ASODN)对肝癌SSMC-7721细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法 常规培养SSMC-7721细胞,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价survivin ASODN联合槲皮素对肝癌细胞增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期;荧光染色观察细胞形态学变化;并通过RT-PCR和免疫组化方法检测survivin基因表达变化.结果 survivin反义寡核苷酸转染SSMC-7721细胞后,可以显著抑制细胞增殖,其抑制作用具有剂量依赖性,且能诱导肝癌细胞凋亡;联合槲皮索和survivin反义寡核苷酸抑制作用更为显著(t=4.317,P<0.01);RT-PCR及免疫组化显示ASODN和槲皮素均使survivin mRNA和蛋白表达下降.结论 survivin基因反义寡核苷酸联合槲皮素能明显抑制肝癌SSMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调survivin基因表达;两者具有协同作用.     

特异性小干扰RNA下调中期因子基因表达对膀胱癌细胞化疗敏感性的影响

目的 观察中期因子(MK)基因小干扰RNA(siRNA)对膀胱癌细胞化疗药物敏感性的影响.方法 设计合成3个MK siRNA,转染人膀胱癌RT4细胞株,定量RT-PCR方法筛选下调MK mRNA效果最好的siRNA;以该siRNA转染RT4细胞后分组:空白对照组(Con-A)、空载对照组(Con-B)、错配对照组及MK siRNA 3.125、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 nmol/L组,实时定量RT-PCR和蛋白质印迹方法检测各组细胞MK表达情况;噻唑盐法检测紫杉醇(PTX)对各组细胞生长的影响;通过检测caspase-3活性和TUNEL方法观察癌细胞凋亡情况.结果 3个siRNA均明显下调MK mRNA水平,以S3效果最好.PTX组、Con-A十PTX组、Con-B+PTX组、siRNA 12.50 nmol/L组、3.125 nmol/L+PTX组、siRNA 6.25 nmol/L+PTX组、siRNA 12.50nmol/L+PTX组肿瘤细胞抑制率分别为(18.21±0.36)%、(18.19±0.29)%、(17.89±0.33)%、(1.86±0.52)%、(32.56±0.53)%、(53.83±0.38)%、(78.95±0.55)%.TUNEL结果显示,ConA、Con-B、siRNA 3.125、6.25、12.50 nmol/L组凋亡指数分别为(1.81±0.36)%、(1.89±0.38)%、(5.56±0.58)%、(9.68±0.55)%和(15.25±0.56)%.结果 MK基因siRNA可增强膀胱癌细胞化疗敏感性,诱导凋亡是其重要机制之一.     

血管内皮生长因子受体启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的CDglyTK融合基因（AdKDR-CDsbrTK）体系联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对结直肠癌细胞（sw620）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增产生重组腺病毒。体外感染表达KDR的SW620、ECV304细胞株,同时用survivin ASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况。应用RT．PCR和Western印迹检测CDglyTK和survivin基因的表达．MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果survivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞,并且两者的转染及感染效率无明显变化。CDglyTK可在SW620、ECV304细胞株高效表达。survivin ASODN可明显降低survivin蛋白表达。各基因治疗组细胞存活率明显低于阴性对照组（P〈0．001）。survivinASODN与AdKDR—CDglyTK基因联用后。随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,两者联合作用与单一基因作用相比,差异具有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5-FC 2000μg／ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间差异无统计学意义（P〉0．05）。Survivin ASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用,在前药浓度较低时表现为协同效应,并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的AdKDR-cDglyTK体系和survivin ASODN基因联合,较单一基因具有更强的特异性杀伤结直肠癌细胞及血管内皮细胞的作用。