EMRE在高糖环境中的变化对心肌细胞凋亡机制的研究

目的 观察db/db糖尿病小鼠心肌细胞及高糖环境诱导下的H9c2心肌细胞中EMRE分子表达水平的变化,探究EMRE分子的表达变化对糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的影响。方法 (1)选取db/db糖尿病小鼠和野生型(WT)小鼠各6只,分别饲养18周,利用蛋白质印迹法、免疫组织化学法及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测小鼠心肌细胞中EMRE的表达水平;小动物超声仪检测小鼠的心脏功能。(2)将购买来的H9c2心肌细胞随机分为四组,即正常组(NG,培养基中含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,培养基中含33 mmol/L葡萄糖)、高糖+阴性对照组(HG+NC siRNA,培养基中含33 mmol/L葡萄糖+阴性对照siRNA)、高糖+转染EMRE组(HG+EMRE siRNA,培养基中含33 mmol/L葡萄糖+转染EMRE siRNA),培养24 h,采用蛋白质印迹法检测四组实验细胞中EMRE、凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9、细胞色素c(Cyto-c)以及凋亡拮抗蛋白MCL-1表达情况;利用流式细胞术检测细胞凋亡水平;ATP检测试剂盒检测各组细胞线粒体...     

褪黑素通过激活Akt信号通路缓解高糖诱发的原代心肌细胞损伤

目的 明确高糖对心肌细胞损伤的影响;揭示褪黑素（Mel）在高糖诱发乳鼠原代心室肌细胞损伤中的作用及机制。 方法 体外培养乳鼠原代心室肌细胞,分为4组:正常葡萄糖浓度组(NG)、高糖组(HG,HG=25 mmo/L)、高糖+褪黑素组（HG+Mel,HG=25 mmo/L;Mel=30 μmo/L）、高糖+褪黑素+ PI3K/Akt抑制剂组（HG+Mel,HG=25 mmo/L;Mel=30 μmo/L;LY294002=50 μmo/L）组,采用Western Blotting、RT-PCR和免疫荧光技术检测心肌细胞凋亡相关蛋白以及PI3K/p-Akt等指标,评价褪黑素对高糖诱发心肌细胞凋亡的作用及机制。 结果 与NG组比较,HG组心肌细胞Cl -Caspase3、Caspase9的mRNA及蛋白表达明显升高,伴有p-Akt的mRNA及蛋白表达降低和PI3K蛋白表达降低;与HG组相比,HG+Mel组心肌细胞Cl-Caspase3、Caspase9的mRNA及蛋白表达下调伴有p-Akt的mRNA及蛋白表达回升和PI3K蛋白表达升高;与HG+Mel组相比,HG+Mel+LY294002组心肌细胞的Cl-Caspase3、Caspase9的mRNA及蛋白表达上升伴有p-Akt蛋白表达水平显著降低和PI3K蛋白表达降低。免疫荧光的结果与Western Blotting、RT-PCR的结果趋势一致。 结论 褪黑素通过激活PI3K/Akt信号通路缓解高糖诱导的原代心肌细胞损伤。     

牛磺酸通过激活PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡

目的 探讨牛磺酸对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响及其信号途径.方法 取健康产妇分娩后12h内的脐带分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC),进行细胞培养并分为5组:正常葡萄糖组(5 mmol/LD-葡萄糖,NG组);高糖组(30 mmol/LD-葡萄糖,HG组);NG+TAU组(5mmol/LD-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸);HG+TAU组(30 mmol/L D-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸);HG+TAU+Wo组(30 mmol/LD-葡萄糖+5 mmol/L牛磺酸+50 nmol/L wortmannin).干预48 h后应用流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western印迹检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白的表达水平,2,7-二氯二氢荧光素二乙酯(H2DCF-DA)探针技术及荧光倒置显微镜检测活性氧簇的相对含量.结果 与NG组相比,HG组细胞的凋亡率显著增加(P＜0.05).与HG组相比,HG+TAU组的凋亡率下降(P＜0.05).与HG+TAU组相比,HG+TAU+Wo组的凋亡率较高(P＜0.05).与NG组相比,HG组磷酸化-Akt蛋白表达下降(P＜0.05).与HG组比较,HG+TAU组磷酸化-Akt蛋白表达增加(P＜0.05).与HG+TAU组相比,HG+TAU+Wo组磷酸化-Akt蛋白表达下降(P＜0.05).牛磺酸可降低高糖诱导的活性氧簇生成(P＜0.05),这一作用亦可被wortmannine所阻断(P＜0.05).结论 牛磺酸通过PI3K/Akt信号途径调节细胞内活性氧簇生成,进而在高糖环境下发挥其抗凋亡作用.     

柚皮素对高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡及Nrf2/ARE信号通路的影响

[目的]探讨柚皮素(NAR)对高糖(HG)诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)凋亡及核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路的影响。[方法]将培养的H9c2细胞分为对照组(正常糖量)、HG组(35.5 mmol/L葡萄糖)、HG+NAR低、中、高浓度组(35.5 mmol/L葡萄糖+6.25、12.5、25.0μmol/L NAR)。用噻唑蓝法检测H9c2细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot法检测Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平。[结果]经HG处理的H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。经HG与NAR共同处理H9c2细胞后,NAR低、中、高浓度组H9c2细胞增殖活性、Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、ROS水平、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P...     

微小RNA-34a调控高糖诱导H9c2心肌细胞凋亡的初步研究

目的探讨微小RNA-34a(miR-34a)对高糖诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为3组:正常组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度33mmol/L),抑制剂组(miR-34a抑制剂浓度50nmol/L+葡萄糖33mmol/L)。采用定量PCR检测miR-34a和凋亡相关基因Bcl-2基因表达的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2表达的变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果与正常组比较,高糖组心肌H9c2细胞凋亡率明显升高(P<0.05),H9c2细胞miR-34a表达显著上调(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达减少(P<0.05)。与高糖组比较,抑制剂组H9c2细胞凋亡明显下降(P<0.05),H9c2细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 miR-34a能调控高糖所致的H9c2心肌细胞凋亡,可能是通过直接抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达而实现的。     

抑制P53上调GLUT4改善高糖合并缺血缺氧诱导的心肌细胞糖代谢紊乱及减轻细胞凋亡

[目的]探讨抑制心肌细胞P53,增加葡萄糖转运体4(GLUT4)表达,能否改善高糖(HG)合并缺血缺氧(IH)诱导的心肌细胞糖代谢紊乱,减轻细胞凋亡。[方法]建立体外HG+IH心肌细胞模型,实验分为：对照组、HG组、IH组、HG+IH组、HG+IH+P53抑制剂组(HG+IH+Pifithrin-α组)、HG+IH+P53抑制剂+GLUT4抑制剂组(HG+IH+Pifithrin-α+Fasentin组)。CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、糖酵解关键酶活性和ATP含量,Western blot检测P53、GLUT4、Bax/Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡。[结果](1)体外HG+IH心肌细胞模型中,与对照组比较,心肌细胞P53表达增加75%,GLUT4表达减少16%,细胞ATP含量下降51%,细胞活力减低45%,LDH活性增加3.6倍,Caspase-3和Bax/Bcl-2表达分别增加54%和77%,细胞凋亡率增加(P均<0.05)。(2)抑制心肌细胞P53表达后,与HG+IH组比较,HG+IH+Pifithrin-α...     

蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤

目的 研究蛋白激酶C(PKC)β_2、PPARα在高糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系.方法 将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照(L,NG+20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖卒载体转染(NN,NG+Ad5-null)组、高糖PKCβ_2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ_2)组、高糖+非诺贝特(HF,HG+40 μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ_2转染+非诺贝特(HBF,HB+40μmol/L非诺贝特)组,另以非诺贝特共孵育20 min作为HF20组,以上各组细胞均培养6 d.以RT-PCR 检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果 (1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(均P<0.05);HB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达较HG组进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(均P<0.05).HF组VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(均P<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义.(2)HG组PPARa蛋白表达较NG组减少了20%,HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%,与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%(P<0.05).(3)HG诱导PKCβ_2核转位激活,定量分析示HG组浆/核荧光强度比值较NC组降低37%(P<0.05),HB组PKCβ_2核转位与HG组相比更加明显.结论 高糖通过诱导HUVECs PKCβ_2核转位,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达.     

吡格列酮对高糖诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞晚期糖基化终末产物受体表达的影响及机制

目的探讨吡格列酮(PIO)对高糖诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)晚期糖基化终末产物受体(RAGE)表达的影响及其作用机制。方法原代培养小鼠主动脉VSMCs分为5组:(1)5. 5 mmol/L葡萄糖(正常浓度葡萄糖组,NG);(2)25 mmol/L葡萄糖(高浓度葡萄糖组,HG);(3)25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L PIO(HG+PIO);(4)25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L PIO+10μmol/L GW9662 (HG+PIO+GW9662);(5) 25 mmol/L葡萄糖+10μmol/L GW9662 (HG+GW9662)。应用RT-PCR及Western blot检测VSMCs中RAGE及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达。结果高糖增加VSMCs中RAGE的mRNA(P=0. 001)和蛋白(P=0. 002)表达;PPAR-γ激动剂PIO可抑制高糖增加VSMCs中RAGE的mRNA(P=0. 014)和蛋白(P=0. 006)表达的作用;加用PPAR-γ抑制剂GW9662后可明显减弱PIO对RAGE的mRNA(P=0. 001)和蛋白(P=0. 004)表达的抑制作用。结论 PIO可通过激活PPAR-γ,抑制高糖诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞RAGE的表达。     

厄贝沙坦通过核转录因子κB信号通路减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡的研究

目的探讨厄贝沙坦通过抑制核转录因子κB(NF-κB)的表达减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡。方法将H9C2细胞分为:对照(Con)组(5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇(Man)组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇)、二甲基亚砜(DMSO)组(5.5 mmol/L葡萄糖+1‰二甲基亚砜)、高糖(HG)组(33 mmol/L葡萄糖)、厄贝沙坦(Ir)组(33 mmol/L葡萄糖+1μmol/L厄贝沙坦),每组3个细胞。检测细胞增殖抑制率;IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、TNF-α、Bax、Bcl-2 mRNA;核转录因子κB(NF-κB)、caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率。结果 Ir组低于高糖诱导的Bax[(50.31±2.18)vs(61.96±4.08)]、IL-6[(7.67±1.53)vs(25.33±4.16)]、MCP-1[(26.67±6.11)vs(43.33±3.06)]、TNF-α[(35.33±3.06)vs(44.67±4.16)]、NF-κB[(2.19±0.52)vs(3.58±0.53)]及caspase-3[(2.28±0.10)vs(2.86±0.12)]表达及细胞凋亡[(10.73±1.78)vs(16.46±2.24)],差异均有统计学意义(P0.05);上调高糖抑制的Bcl-2[(0.62±0.04)vs(0.45±0.06)]的表达(P0.05)。结论厄贝沙坦通过NF-κB信号通路,可减轻高糖诱导的H9C2细胞炎症反应及凋亡。     

波动性高糖对INS-1细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的探讨波动性高糖对INS-1细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响及其分子机制。方法将INS-1细胞随机分为三组。正常对照组(NG):含5.5 mmol/L葡萄糖;持续高糖组(SHG):含33.3 mmol/L葡萄糖;波动性高糖组(IHG):含5.5 mmol/L或33.3 mmol/L葡萄糖,每24 h交替换液1次,均培养3 d。3 d后检测各组INS-1细胞活性及凋亡百分率,胰岛素分泌量,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(CytC)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达水平以及胰岛素(insulin)和胰岛十二指肠同源盒-1(PDX-1)mRNA表达水平。结果与NG组相比,SHG组与IHG组凋亡率均明显升高,细胞活性明显降低,Bax、CytC及Caspase-3表达明显增强,胰岛素分泌量及insulin、PDX-1 mRNA表达水平均明显降低(P均<0.01);与SHG组相比,IHG组细胞活性及胰岛素分泌量明显降低,凋亡率及Caspase-3明显增加(P均<0.01),Bax、CytC表达水平与insulin及PDX-1 mRNA表达水平均未见统计学差异。结论波动性高糖能导致胰岛细胞凋亡增加和功能障碍,其机制可能与上调Bax、CytC、Caspase-3及降低insulin与PDX-1基因表达等相关。     

艾塞那肽对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的保护作用及机制研究

目的探讨艾塞那肽对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用及相关机制。方法将足细胞系MPC5细胞按照不同葡萄糖培养浓度和干预因素分为以下5组:正糖对照组(5.5 mmol/L葡萄糖,n=3)、甘露醇高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇,n=3)、高糖组(25.0 mmol/L葡萄糖,n=3)、高糖+艾塞那肽组(25.0 mmol/L葡萄糖+100 nmol/L艾塞那肽,n=3)和高糖+艾塞那肽+LY294002组(25.0 mmol/L葡萄糖+100 nmol/L艾塞那肽+50μmol/L磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂LY294002,n=3)。采用原位缺口末端标记法荧光染色观察细胞凋亡,膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞内裂孔膜肾病蛋白(nephrin)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)以及磷酸化Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动子(p-BAD)水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用最小显著性差异t检验。结果与正糖对照组和甘露醇高渗对照组比较,高糖组足细胞凋亡率显著增加[分别为(28.60±2.65)%、(4.50±0.75)%和(4.55±0.65)%,t=-19.19、-19.15,均P<0.01],细胞内nephrin蛋白表达降低(分别为0.22±0.03、0.72±0.06和0.73±0.08,t=11.43、11.52,均P<0.01),p-AKT和p-BAD蛋白表达下调(分别为0.14±0.03、0.83±0.06和0.86±0.04,0.16±0.03、0.66±0.06和0.68±0.04,均P<0.01)。与高糖组比较,高糖+艾塞那肽组足细胞凋亡率显著下降,细胞内nephrin表达升高,p-AKT和p-BAD蛋白表达上调(均P<0.01)。而高糖+艾塞那肽+LY294002组较高糖+艾塞那肽组足细胞凋亡率增加,细胞内nephrin蛋白表达降低,p-AKT和p-BAD蛋白表达下调(均P<0.05)。结论艾塞那肽通过上调足细胞中nephrin蛋白表达和减少足细胞凋亡从而保护高糖诱导的足细胞,其机制可能与激活AKT/BAD信号途径有关。     

动力相关蛋白1通过诱导线粒体自噬对高糖导致心肌细胞损伤的影响

目的明确动力相关蛋白(Drp)1通过诱导线粒体自噬对高糖条件下心肌细胞起保护作用。方法以Lac Z空病毒(LV-Lac Z)或Drp1过表达腺病毒(LV-Drp1)转染大鼠原代心肌细胞24 h,再用含葡萄糖(5.5 mmol/L)的正常培养基(NG)或含葡萄糖(33 mmol/L)的高糖培养基(HG)处理大鼠心肌细胞72 h。实验分组:1:(1)阴性对照(NG+Lac Z)组;(2)正常Drp1过表达(NG+Drp1)组;(3)高糖阴性对照(HG+Lac Z)组;(4)高糖Drp1过表达(HG+Drp1)组。采用免疫荧光法检测自噬体数量,用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平,采用Western blot法检测Drp1、Parkin(一种E3泛素化连接酶),微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62蛋白表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比,高糖处理组自噬体数量明显减少(P0.05),线粒体膜电位显著下降(P0.05),线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Parkin水平下调(P0.05),Drp1,P62表达水平显著增高(P0.05),心肌细胞凋亡率升高(P0.05);与高糖组比较,Drp1过表达组可显著增加自噬体数量(P0.05),线粒体膜电位上升(P0.05),Drp1,Parkin,LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P0.05),P62水平显著下降(P0.05),心肌细胞凋亡率下降(P0.05)。结论高糖可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬水平降低和线粒体功能障碍,是糖尿病心肌病发病机制之一。Drp1通过提高线粒体自噬水平改善线粒体功能,降低高糖条件下心肌细胞凋亡率。     

高糖通过Rho/ROCK信号通路诱导人肾小球系膜细胞的炎症反应及纤维化

目的 探讨Rho/ROCK信号通路在高糖诱导的人肾小球系膜细胞(HMCs)炎症反应及纤维化中的作用.方法 将传代培养的HMCs同步化后分组:(1)正常糖浓度对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖);(2)高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖);(3)甘露醇渗透压对照组(Man,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);(4)NG+Y-27632(10 μmmol/L)组;(5)HG+Y-27632(10 μmmol/L)组,培养12、24、36、48、72 h后收集上清及细胞,用Western印迹检测RhoA蛋白的活化,用实时PCR检测细胞中RhoA、ROCK-Ⅰ、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA浓度的变化,用ELISA方法检测上清中纤维连接蛋白(FN)、CTGF、TNF-α的蛋白含量.结果 (1)高糖刺激HMCs的RhoA活化,于30 min即可出现活性升高,1 h达到高峰,之后活化的RhoA表达逐渐下降(P=0.02).(2)高糖培养下的HMCsRhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF、TNF-α mRNA的表达较NG组明显升高(P＜0.05),并有一定的时间依赖性,Man组与NG组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(3)经Y-27632预处理后,在正常糖和高糖浓度培养24 h或48 h后,NG+Y-27632组和HG+Y-27632组与未处理组相比RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF、TNF-α mRNA的表达明显下降(P＜0.01).(4)高糖呈时间依赖方式增加HMCs的FN、CTGF、TNF-α分泌(P＜0.05).(5)经Y-27632预处理,继续培养12、24、36、48、72 h后NG组和HG组中FN、CTGF、TNF-α蛋白的分泌较处理前明显降低(P＜0.05).结论 高糖可通过Rho/ROCK信号通路介导HMCs的炎症反应和纤维化,抑制此通路可作为减缓糖尿病肾病发生发展的潜在靶点.

Abstract：

Objective To investigate the role of Rho/ROCK signaling pathway in the process of human mesangial cells (HMCs) inflammation and fibrosis induced by high glucose. Methods Synchronized HMCs were divided into following groups: ( 1 ) Normal glucose control group ( NG, 5.5 mmol/L glucose); ( 2 ) High glucose group ( HG, 30 mmol/L glucose); (3) Mannitol group( Man,5.5 mmol/L glucose+ 24.5 mmol/L mannitol); (4) NG +Y-27632 group( 10 μ mmol/L Y-27632 ); ( 5 ) HG Y-27632 group ( 10 μmmol/L Y-27632 ). The supernatant and cells were collected at 0,12,24,36,48, and 72 h. Western blot was used to detect the active RhoA and total RhoA,while RhoA, ROCK-Ⅰ, CTGF, and TNF-α mRNA expressions were determined with realtime PGR method in the cells, then ELISA method was used to check protein levels of FN, CTGF, and TNF-α in the supernatant. Results ( 1 ) RhoA activation was stimulated after treatment for with 30 mmol/L glucose, peaked at 1 h, and then decreased ( P = 0. 02). (2) RhoA, ROCK-Ⅰ, CTGF, and TNF-α mRNA expressions in HMC cultured under high glucose were higher than those in the normal group ( P ＜ 0.05 ), and there was certain time-dependence. Besides, there was no statistical significance between Man and NG groups( P＞0. 05 ). ( 3 ) After Y-27632 pretreatment and being cultured with normal glucose and high glucose for24 h or48 h, RhoA, ROCK-Ⅰ, CTGF, and TNF-α mRNA expressions were significantly decreased ( P＜0.01 ) as compared with groups without treatment. (4) High glucose increased FN, CTGF,and TNF-α protein secretion of HMC in a time-dependent manner( P＜0. 05 ). ( 5 ) After Y-27632 pretreatment and being cultured with normal and high glucose for 12,24,36,48,72 h, FN, CTGF, and TNF-α protein secretions were significantly reduced( P＜0.05 ). Conclusion Rho/ROCK signaling pathway may mediate inflammation and fibrosis induced by high glucose in HMCs, supporting a potential role for inhibitors of Rho/ROCK in the treatment of diabetic nephropathy.     

升糖速度对低血糖大鼠脑损伤影响机制初探

目的 研究及探讨不同升糖速度对低血糖性大鼠脑损伤影响的机制.方法 采用健康SD雄性大鼠36只,体重250～ 300 g,采用简单随机抽样分组的方式将其分为6组：空白组、假手术组和4个实验组,每组6只大鼠.空白组不作任何处理,假手术组胰岛素腹腔注射的同时静脉泵注葡萄糖并维持正常血糖,4组实验组在胰岛素诱导的低血糖后按照不同的泵注速度进行升糖,根据1h后血糖的不同水平分为＞ 1.0 ～ 3.0 mmoL/L组、＞3.0 ～6.0 mmoL/L组、＞6.0 ～9.0 mmol/L组和＞9.0 mmol/L组.采用Western blotting法检测不同组之间抗凋亡基因Bax及Bcl-2蛋白在大脑皮层及海马神经细胞上表达,采用流式细胞仪检测不同组之间大脑海马及皮层神经细胞内Ca^2＋的浓度.各组间计量资料比较采用单因素方差分析.结果 Bax/Bcl-2比值：相对于空白组,假手术组、4个实验组大脑皮层及海马的Bax/Bcl-2比值有显著性的提高,差异有统计学意义（F=265.8、42.7,均P＜0.05）,其中＞9.0 mmol/L组Bax/Bcl-2最大,＞1.0～3.0 mmol/L组次之,与＞3.0～ 6.0 mmol/L组、＞6.0 ～9.0 mmol/L组之间差异有统计学意义（F=212.1、27.4,均P＜0.05）.钙离子浓度：相对于空白组,假手术组和4个实验组的钙离子浓度显著性的提高,差异有统计学意义（F=79.8、355.0,均P＜0.05）,其中＞9.0 mmol/L组钙离子浓度最大,＞1.0～ 3.0 mmol/L组次之,与3.0 ～6.0 mmol/L组、＞6.0 ～ 9.0 mmol/L组之间差异有统计学意义（F=50.1、71.1,均P＜0.05）.结论 过慢、过快的升糖速度都不利于低血糖性脑损伤的恢复.     

法舒地尔通过Rho/ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响

目的 体外实验研究法舒地尔(fasudil)通过抑制Rho/ROCK信号通路对高糖培养下的人肾小球系膜细胞(HMCs)炎症反应及其纤维化的影响.方法 传代培养的HMCs同步化后分组:(1)正常糖浓度对照组(NG,含葡萄糖5.5 mmol/L);(2)高糖组(HG,含葡萄糖30.0 mmol/L);(3)甘露醇渗透压对照组(Man,含5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);(4)高糖+法舒地尔处理组(HG+F组,法舒地尔浓度分别为25、50、100 μmol/L).培养12、24、36、48、72 h收集上清及细胞,用实时PCR检测细胞中小G蛋白(RhoA)、小G蛋白激酶-Ⅰ(ROCK-Ⅰ)、纤维结缔组织生长因子(CTGF)mRNA浓度的变化,用ELISA方法检测上清中纤维连接蛋白(FN)、CTGF、TNFα的蛋白含量.结果 (1)高糖培养下的HMCs中RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达较NG组明显升高(P＜0.05),并有一定的时间依赖性,Man组与NG组相比差异无统计学意义(P＞0.05).(2)正常培养的HMCs经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养24 h或48 h,HG+F组与HG组对比,RhoA、ROCK-Ⅰ、CTGF mRNA的表达明显下降(P＜0.05),并有一定的浓度依赖性.(3)高糖呈时间依赖方式增加HMCs对FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌(P＜0.05),而NG组和Man组无此作用(P＞0.05).(4)经不同浓度法舒地尔预处理后,高糖继续培养12、24、36、48、72 h后FN、CTGF、TNFα蛋白的分泌较HG组明显降低(P＜0.05).结论 法舒地尔通过抑制高糖激活的HMCs的Rho/ROCK信号转导通路,从而降低下游的炎性因子和细胞因子的分泌,减少HMCs的炎症反应及纤维化,为糖尿病肾病的治疗提供新的依据.

Abstract：

Objective To study the effect of fasudil on inhibiting the Rho/ROCK signaling pathway under high glucose in human mesangial cells (HMCs) inflammation and fibrosis. Methods Synchronized HMCs were divided into following groups: (1) Normal glucose control group ( NG, 5. 5 mmol/L glucose) ;(2) High glucose group (HG, 30 mmol/L glucose) ; (3) Mannitol group (Man, 5.5 mmol/L glucose + 24. 5 mmol/L mannitol) ; (4) High glucose + fasudil group ( HG + F, the concentrations of fasudil were 25 ,50 and 100 μmol/L, respectively). Collect the supernatant and cells at 0, 12, 24, 36, 48 and 72 h respectively, and determine the concentration changes of the RhoA, ROCK- Ⅰ, connective tissue growth factor (CTGF)mRNA with real-time PCR method in the cells, then used the ELISA method to check the protein content of the fibronectin ( FN) , CTGF, TNFα in the supernatant. Results ( 1) RhoA, ROCK- Ⅰand CTGF mRNA of the HMCs cultured under the high glucose expressed significantly higher than those in the normal group, and there was certain time-dependence. Besides, there was no statistic significance by comparing Man and NG. (2) Under the high glucose situation, after the fasudil pretreatment with different concentrations and 24 h or 48 h culture with high glucose, RhoA, ROCK- Ⅰ , CTGF mRNA expression was significantly decreased in HG + F, compared with HG, and there was certain concentration-dependence. (3) High glucose increased the FN, CTGF, TNFα protein secretion of HMCs in a time-dependent manner, but normal glucose and mannitol had no such effect. (4) After the fasudil pretreatment with different concentrations and culture with high glucose for 12, 24, 36, 48, 72 h, the FN, CTGF, TNFα protein secretion was significantly reduced compared with HG. Conclusion Fasudil can reduce the secretion of downstream inflammatory factors and cytokines by inhibiting high glucose-activated HMCs Rho/ROCK signaling pathway, and reduce the inflammation and fibrosis of HMCs. This provides a new basis for the therapeutic target in the treatment of diabetic nephropathy.     

蛋白激酶Cβ_2-活性氧交互环介导高糖致内皮细胞损伤记忆效应

目的 以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为体外模拟高血糖记忆的研究对象,观察蛋白激酶C(PKC)β_2、活性氧(ROS)对其表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1) mRNA的影响,并探讨PKCβ_2、ROS在其中可能的交互作用.方法 将培养的HUVECs分为以下5组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖×3周)组、高糖(HG,25 mmol/L D.葡萄糖×3周)组、记忆(M,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D.葡萄糖×1周)组、记忆PKCβ_2转染[MB,25 mmol/LD-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×l周+PKCβ_2重组腺病毒(Ad5-PKCβ_2)]组、记忆+α-硫辛酸(MA,25 mmol/L D-葡萄糖×2周+5 mmol/L D-葡萄糖×1周+62.5μmol/Lα-硫辛酸)组.以RT-PCR法检测VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,用荧光显微镜和荧光酶标仪测定ROS水平,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果(1)HG组和M组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.76倍、1.35倍和1.69倍、1.43倍(P值均<0.05).(2)HG组和M组ROS水平分别较NG组升高了86%、80%(P值均<0.05);MA组ROS水平较M组下降了38%,同时MA组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组显著下调,分别为M组的67%、78% (P值均<0.05).(3)HG组和M组PKCβ_2:核转位激活,定量分析显示,胞质/胞核荧光强度比值均较NG组下降,分别为NG组的70%、74% (P值均<0.05);MB组PKCβ_2核转位较M组更为明显,胞质/胞核荧光强度比值为M组的77%,同时MB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达亦较M组进一步上调,分别为M组的1.29倍、1.18倍(P值均<0.05).(4)MA组PKCβ_2:核转位较M组减少,胞质/胞核荧光强度比值为M组的1.18倍;而MB组ROS水平较M组上调了25% (P值均<0.05).结论 HUVECs存在高糖记忆效应,PKCβ_2-ROS交互环可能介导了这个效应的发生.     

硼替佐米对胰腺癌细胞BxPC3、SW1990生长抑制作用的体外研究

目的 观察硼替佐米对胰腺癌细胞BxPC3、SW1990增殖、凋亡的影响,探讨硼替佐米杀伤癌细胞的可能机制.方法 应用1、10、50、100、500 nmol/L及1、10 μmol/L的硼替佐米干预BxPC3、SW1990细胞,以硼替佐米未干预的细胞作为对照组.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR法检测Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xl、survivin mRNA表达;蛋白质印迹法检测pro-caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、surviving蛋白表达.结果 大于50 nmol/L的硼替佐米干预胰腺癌BxPC3、SW1990细胞时,呈浓度及时间依赖性抑制细胞的增殖,其中硼替佐米对BxPC3细胞的生长抑制作用显著大于对SW1990细胞的作用,两者差异有统计学意义（P值均＜0.05）.100 nmol/L硼替佐米干预组BxPC3和SW1990细胞凋亡率分别为（22.56±4.23）％和（（12.71±2.23）％,显著高于对照组的（2.15±0.47）％和（2.32±0.54）％（P值均＜0.05）,且BxPC3细胞的凋亡率显著高于SW1990细胞（P＜0.05）.100 nmol/L硼替佐米干预48 h后BxPC3和SW1990细胞的Bak mRNA表达无显著变化,Bax mRNA及蛋白表达显著增加（P值均＜0.05）,Bcl-2 mRNA和蛋白表达及Bcl-xl mRNA表达均减少（P值均＜0.05）.survivin mRNA和蛋白表达在BxPC3细胞中均减少,而在SW1990细胞中均增加（P值均＜0.05）.2株细胞的pro-caspase-3蛋白表达减少,而cleaved-caspase-3蛋白表达增加（P值均＜0.05）.结论 硼替佐米可抑制胰腺癌细胞BxPC3、SW1990的增殖、诱导凋亡,对BxPC3细胞的作用高于对SW1990细胞,其机制可能与激活线粒体内源性凋亡途径及survivin参与的肿瘤耐药相关.     

亚精胺对心肌梗死大鼠心肌线粒体功能及细胞凋亡的影响

目的:探讨亚精胺对心肌梗死大鼠心肌线粒体功能及细胞凋亡的影响。方法:选取健康SD大鼠32只,随机分为假手术组、模型组、模型+阿司匹林组、模型+亚精胺组,每组8只,利用在体结扎冠状动脉前降支法建立急性心肌梗死模型。造模成功后假手术组和模型组给予无菌生理盐水(2 mL)灌胃,模型+阿司匹林组以等体积阿司匹林(20 mg/kg)灌胃,模型+亚精胺组以等体积亚精胺(5 mmol/L)灌胃,连续4周。TTC染色、HE染色观察心肌组织梗死面积和病理学改变;透射电镜观察心肌线粒体形态;原位缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌组织细胞凋亡水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3(caspase-3)的mRNA表达水平;Western blot检测Bcl-2、Bax、caspase-3、细胞色素C(cytochrome C)的蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织梗死区面积增加,心肌组织细胞凋亡明显增加,心肌组织Bax、caspase-3、cytochrome C表达水平明显升高,Bcl-2表达水平明显降低(P均<0.01);与模型组比较,模型+亚精胺组大鼠心肌组织梗死区面积减少,心肌组织细胞凋亡及Bax、caspase-3、cytochrome C表达水平均明显减少(P<均0.05);与模型+阿司匹林组比较,模型+亚精胺组心肌组织细胞凋亡明显降低(P<0.01),两组心肌组织Bax、caspase-3、Bcl-2、cytochrome C表达水平的差异无统计学意义。结论:亚精胺可改善心肌线粒体功能,抑制细胞凋亡,改善心肌梗死。     

高胰岛素对近端肾小管上皮细胞利用β-羟丁酸供能的影响

目的研究高胰岛素对低糖环境下近端肾小管上皮(HK2)细胞利用β-羟丁酸(BHB)供能的影响及其机制。方法在无糖及低糖环境下,用不同浓度BHB(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)干预HK2细胞24 h,检测BHB对HK2细胞增殖能力的影响。在不同时间(0、6、12、24、48 h)下,检测2.0 mmol/L BHB对HK2细胞三磷酸腺苷(ATP)产生的影响。将HK2细胞分为正常对照(NC)组、低糖(LG)组、BHB干预(LG+BHB)组和高胰岛素(LG+BHB+HI)组,检测HK2细胞促凋亡基因Bax mRNA表达水平,抗凋亡基因Bcl2 mRNA、细胞凋亡数量、回吸收白蛋白、ATP产生、线粒体数量以及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(PGC1α)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体动力相关蛋白1(DRP1)蛋白及mRNA表达水平变化。采用不同浓度的胰岛素(5、50 ng/ml)干预HK2细胞,检测Na+偶联单羧酸转运蛋白1(SMCT1)蛋白及mRNA表达水平。两组间比较采用t检验,多组之间比较采用单因素方差分析。结果在无糖环境下,与0 mmol/L BHB组相比,2.0 mmol/L BHB组HK2细胞增殖能力增加(P<0.05);在低糖环境下,与0 mmol/L BHB组相比,2.0 mmol/L BHB组细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。与2.0 mmol/L BHB干预0 h组相比,2.0 mmol/L BHB干预24 h组HK2细胞ATP产生明显增加(P<0.05)。与NC组相比,LG组HK2细胞Bax mRNA表达、细胞凋亡数量、DRP1 mRNA表达均增加(P<0.05),Bcl2 mRNA表达水平、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1蛋白表达均降低(P<0.05);与LG组相比,LG+BHB组HK2细胞Bax mRNA、细胞凋亡数量、DRP1 mRNA表达均降低(P<0.05),Bcl2 mRNA表达、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1 mRNA及蛋白表达均增加(P<0.05);与LG+BHB组相比,LG+BHB+HI组HK2细胞Bax mRNA、细胞凋亡数量和DRP1 mRNA表达均增加(P<0.05),Bcl2 mRNA、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05)。与5 ng/ml胰岛素干预组相比,50 ng/ml胰岛素组细胞SMCT1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05)。结论高胰岛素可抑制近端肾小管上皮细胞对酮体的利用,机制可能与其抑制酮体回吸收蛋白SMCT1的表达有关。