放射性肝损伤的血清比较蛋白质组学分析

目的: 通过分离、鉴定及验证SD肝硬化大鼠肝脏放疗前后血清差异蛋白质的表达,探讨可能用于检测及监控放射性肝损伤的早期生物学指标。方法: 8只健康成年SD大鼠皮下注射四氯化碳(CCl₄),连续6周,建立肝硬化模型后随机分组,每组4只,即对照组和实验组。对照组大鼠(CCl₄组)未给予放疗,实验组大鼠(CCl₄+放疗组)行半肝照射,单次剂量15 Gy。6 h后分别提取2组大鼠的血清总蛋白,进行比较蛋白质组学分析。采用双向凝胶电泳分离蛋白,经图像分析识别2组大鼠放疗前后差异表达的蛋白质。应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD-TOF-MS)鉴定差异蛋白质。应用Western blotting对血清中乙酰肝素酶和肝细胞生长因子受体的表达水平进行验证。结果: 获得了分辨率和重复性均较好的凝胶蛋白图谱。共筛选出33个在实验组明显差异表达的蛋白点,其中12个蛋白质鉴定成功。在这12个蛋白质中,实验组中5个表达上调,7个表达下调。Western blotting进一步证实了实验组乙酰肝素酶表达上调,肝细胞生长因子受体表达下调。结论: 成功鉴定了12个与放射性肝损伤相关的蛋白。乙酰肝素酶和肝细胞生长因子受体可能作为预测及监控放射性肝损伤的早期指标。临床上要将二者作为可能的生物学标志物,其敏感性和特异性还有待进一步研究。     

不同转移潜能鼻咽癌细胞株的差异膜蛋白质组研究

目的:采用定量蛋白质组学技术筛选鼻咽癌转移相关的膜蛋白质。方法:在富集高转移鼻咽癌细胞株5–8F和不转移鼻咽癌细胞株6–10B膜蛋白质的基础上,采用稳定同位素18O标记结合串联质谱技术比较两株细胞膜蛋白质组的差异,采用Western印迹对差异表达膜蛋白质EphA2的表达水平进行验证,采用生物信息学方法对差异蛋白质进行GO(gene oncology)功能聚类和全基因组及代谢途径数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路分析。结果:鉴定了31个5–8F与6–10B细胞的差异膜蛋白,其中25个蛋白质在5–8F中表达上调、6个蛋白质表达下调,Western印迹技术验证了差异膜蛋白质EphA2的表达。生物信息分析显示,差异膜蛋白的功能主要涉及细胞黏附、受体再循环和细胞连接等生物学过程,并参与了14个KEGG通路,其中许多通路涉及细胞黏附、细胞连接以及细胞运动。结论:31个差异膜蛋白质可能在鼻咽癌转移过程中发挥重要作用,为进一步研究鼻咽癌转移的分子机制提供了新线索。     

人膝骨关节炎血清生物学标志物的筛选

目的: 比较膝骨关节炎患者与正常人血清蛋白质组的差异,筛选其能用于骨关节炎诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标志物。方法: 利用双向荧光差异凝胶电泳技术比较膝骨关节炎患者血清(4例)与健康志愿者血清(4例)蛋白图谱的差异,使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱及生物信息学相关技术对获得的差异蛋白进行鉴定和初步分析,并用Western blotting进一步验证所鉴定的蛋白。结果: 成功建立了骨关节炎血清差异蛋白质组学的研究方法;通过质谱分析初步鉴定出8个差异蛋白,其中5个蛋白在膝骨关节炎组表达上调,3个蛋白在膝骨关节炎组表达下调。Western blotting进一步验证得到α₂-巨球蛋白在膝骨关节炎组表达上调,与双向荧光胶内差异凝胶电泳技术联合质谱分析的结果一致。结论: 膝骨关节炎患者血清与正常人血清蛋白表达存在明显差异,其中α₂-巨球蛋白可作为骨关节炎潜在的疾病相关生物学标志物进一步研究,为骨关节炎的诊断、治疗和发病机制的研究提供新的线索和实验基础。     

三七皂苷单体R1 抑制低氧高二氧化碳诱导的肺动脉平滑肌细胞p38 MAPK信号通路的活化

目的: 探讨三七皂苷单体R₁(R₁)减轻低氧高二氧化碳(CO₂)性肺动脉收缩的作用及其与p38 MAPK信号通路的关系。方法: 原代培养雄性SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),取第2至5代对数生长期细胞至低氧高CO₂(1% O₂, 6% CO₂)条件下继续培养,并分别用8、40、100 mg/L R₁ 孵育24 h后收集细胞,采用免疫印迹法测定p38 MAPK磷酸化蛋白表达,半定量RT-PCR检测p38 MAPK mRNA的表达。结果: Western blotting和RT-PCR结果显示,低氧高CO₂组p-p38 MAPK蛋白和p38 MAPK mRNA表达明显高于对照组(N)组(P<0.01)。与低氧高CO₂组相比,R₁(8、40、100 mg/L)不同程度抑制了p-p38 MAPK蛋白和p38 MAPK mRNA的表达(P<0.01),并呈剂量依赖关系。结论: 低氧高CO₂诱导PASMCs p38 MAPK活化,三七皂苷单体R₁可能通过抑制p38 MAPK通路减轻低氧高CO₂性肺动脉收缩。     

小鼠β2m正反义核酸表达载体转染NIH3T3细胞后的表达

目的:探讨小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN对NIH3T3细胞表达β₂m的影响, 为降低MHCⅠ类分子表达的研究提供新方法和实验依据。方法:本研究应用分子生物学技术,构建小鼠β₂m正、反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mSN和pcDNA3-β₂mAN,用脂质体转染NIH3T3细胞。经过RT-PCR及Western blot检测,观察正、反义核酸对细胞β₂m mRNA和蛋白表达的影响。 结果: 小鼠β₂m正、反义核酸表达载体成功导入NIH3T3细胞中,且有效表达,转染正义核酸的细胞β₂m mRNA和蛋白表达水平升高,而转染反义核酸则β₂m mRNA和蛋白表达水平降低。 结论:小鼠β₂m反义核酸表达载体pcDNA3-β₂mAN可以降低NIH3T3细胞β₂m基因的表达,本研究结果为降低MHCⅠ类分子的表达、解决同种异体排斥反应提供了新的研究方法和途径。     

血管紧张素Ⅱ受体在大鼠肝星状细胞上的表达

目的: 了解血管紧张素Ⅱ的I_a亚型受体(AT_1a)在大鼠肝星状细胞中的表达情况。方法: 大鼠肝脏经链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶循环灌注后, 以11% Nycodenz密度梯度离心, 分离获得肝星状细胞。提取肝星状细胞的总核糖核苷酸(RNA), 以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和PCR产物测序方法检测AT_1a表达。结果: 采用RT-PCR技术检测到大鼠肝星状细胞有AT_1a mRNA表达, 且PCR产物的测序结果与GenBank上AT_1a cDNA序列有94%的一致性。结论: AT_1a mRNA在大鼠肝星状细胞上表达, 从而又为探索肝纤维化的发生机制提供了有力的依据。     

慢性低氧高二氧化碳诱导肺动脉高压小鼠肺组织白细胞介素6的表达

目的: 通过观察慢性低氧(O₂)高二氧化碳(CO₂)小鼠肺组织白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)的表达水平变化,探讨其在慢性低O₂高CO₂肺动脉高压形成过程中的作用。方法: 16只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为正常对照组和低氧高CO₂组,每组8只。低氧高CO₂组置于常压低O₂高CO₂舱内, O₂浓度9%~10%,CO₂浓度5%~6%,每天8h,每周6 d,共4周。4周后,分离右心室和左心室加室间隔,计算右心肥大指数,肺组织行苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜观测肺血管结构变化,Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量管壁厚度占血管外径的百分比(WT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)。免疫组织化学方法观测肺动脉中IL-6蛋白的表达,ELISA测定肺组织匀浆中IL-6蛋白浓度;RT-PCR检测肺组织中IL-6 mRNA表达。结果: 低氧高CO₂组与对照组相比:(1)右心肥大指数、WT%和WA%显著提高(P<0.01);(2)肺组织中IL-6的蛋白表达水平显著提高(P<0.01);(3)肺组织中IL-6 mRNA表达水平明显提高(P<0.05)。结论: 在慢性低氧高二氧化碳环境中,小鼠的肺组织IL-6水平升高伴随肺血管壁肌层增厚和管腔狭窄,这可能与小鼠的肺动脉高压发生、发展有关。     

肠道病毒71型3C蛋白表达后细胞蛋白质组差异分析

目的 利用蛋白质组学技术研究肠道病毒71型(EV71)编码3c蛋白对宿主细胞蛋白表达的影响.方法 在293T细胞中瞬时过表达EV71 3C蛋白,应用双向荧光差异凝胶电泳(20-DICE)检测3C表达后293T细胞中蛋白的差异.选取表达水平有明显变化的蛋白用Western blot进行验证.结果 在293T细胞中过表达3...     

非小细胞肺癌中P53表达的不同亚细胞定位及功能意义的研究

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中不同亚细胞定位P53蛋白及其可能的功能意义。方法:以免疫组化及流式细胞分析术研究了43例NSCLC病人肿瘤组织P53表达定位与G₁/S检查点功能及DNA含量的关系。结果:发现P53蛋白不同的亚细胞定位与病人的病程密切相关,同时,在P53核表达定位的病人肿瘤组织细胞S期比例明显增多而G₀－G₁期比例明显较胞浆表达病人减少,G₂－M期比例及DNA指数在两组间无明显差异。结论:不同亚细胞定 位的P53蛋白具有不同的G₁/S检查点调节功能,胞浆P53蛋白仍有部分G₁/S检查点调控功能,因此出现较少的SPF及较多的G₀－G₁细胞,代表了恶性度较低的细胞亚群;而核表达阳性P53蛋白具有更差的G₁/S检查点调控功能,代表了恶性度较高的肿瘤亚群,这与肿瘤进展可能有关。     

孕酮对氧糖剥夺损伤的PC12细胞的保护作用

目的: 观察孕酮(PROG)对氧糖剥夺(OGD)PC12细胞活力及葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)表达的影响,在培养细胞证明孕酮抗缺氧缺血损伤的神经保护作用。方法: 神经生长因子诱导分化良好的PC12细胞,随机分为3组:(1)正常对照组:常规培养,不进行OGD处理;(2)OGD组:无糖培养基、低氧环境(95%N₂和5%CO₂持续通气)进行OGD 30 min处理,然后复氧复糖培养24 h;(3)PROG +OGD组:培养液含终浓度为10 nmol/L 孕酮,余同OGD组。WST-8法检测各组PC12细胞的活力;检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性,判断细胞损伤的程度;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测PC12细胞GLUT1 mRNA和GLUT3 mRNA表达;Western blotting法检测PC12细胞GLUT3蛋白表达。结果: 孕酮可以减轻OGD引起的PC12细胞肿胀,降低LDH漏出,减轻细胞损伤,显著增加OGD组PC12细胞的活力(P<0.01)。RT-PCR显示PROG +OGD组GLUT3 mRNA的表达明显高于OGD组(P<0.05),Western blotting显示PROG +OGD组GLUT3蛋白的表达显著高于OGD组(P<0.01)。结论: 孕酮对体外培养OGD损伤的PC12细胞具有保护作用,其机制可能与上调GLUT3蛋白的表达有关。     

低氧下小鼠肝细胞的细胞化学变化

目的　探讨低氧时小鼠肝细胞的细胞化学变化。　方法　实验用雄性小白鼠 45只 ,低氧组 36只 ,对照组 9只 ,低氧仓氧浓度为 10 %。用组织化学和图象分析方法 ,检测小鼠在低氧条件下肝细胞PAS ,乳酸脱氢酶(LDH) ,细胞色素氧化酶和镁离子依赖性ATPase活性。　结果　低氧组乳酸脱氢酶活性随低氧时间延长而升高 ;肝细胞色素氧化酶活性随低氧时间延长而降低。　结论　 10 %低氧浓度可造成小白鼠肝细胞损伤 ,出现明显的细胞化学改变。     

太子参多糖减轻高脂诱导的小鼠肝脏胰岛素抵抗

目的:通过研究太子参多糖(Radix Pseudostellariae polysaccharide,RPP)减轻高脂肪诱导肝脏胰岛素抵抗的作用,探寻其主要影响因素及发生的分子机制。方法:随机将C57BL/6J小鼠分为低脂饲料对照组(LFD组)和高脂饲料组(HFD组),16周后,经腹腔注射丙酮酸耐量试验(IPPTT)确定胰岛素抵抗糖代谢紊乱模型成功后,开始进行含RPP(500 mg/kg)的高脂饲料干预(HFD+RPP组),连续干预4周之后,检测丙酮酸耐量以及肝脏组织和线粒体丙二醛(MDA)含量。同时采用Western blot法检测肝脏组织中p-AKT(Ser473/Thr308)、p-AMPK、核因子E2相关因子2(Nrf2)、NQO1和IκBα的蛋白水平变化。结果:经RPP干预后,模型组小鼠血糖水平明显降低;肝脏和线粒体的MDA水平显著降低;肝脏组织p-AKT及p-AMPK的蛋白水平明显增高;NQO1、HO-1和IκBα蛋白水平也同时上调。结论:太子参多糖能够有效抑制高脂肪诱导的C57BL/6J小鼠高血糖作用,其机制可能与改善肝脏胰岛素信号转导,并减轻氧化应激反应,同时激活Nrf2信号通路及抑制肝脏炎症信号激活作用有关。     

cPKCγ-HSP60信号通路参与小鼠脑低氧预适应

目的: 鉴定参与低氧预适应(HPC)的常规型蛋白激酶Cγ (cPKCγ)相互作用蛋白,探讨与cPKCγ相互作用的热休克蛋白60(HSP60)表达水平在小鼠脑低氧预适应和脑缺血中的变化。方法: 健康雄性BALB/c小鼠,随机分为: 常氧组(Norm)和HPC组,结合是否进行大脑中动脉阻塞(MCAO)分为常氧假手术组(Norm+sham)、常氧缺血组(Norm + I)、HPC假手术组(HPC+sham)和HPC缺血组(HPC+I)。应用整体低氧预适应和MCAO缺血模型,结合免疫沉淀、双向凝胶电泳、质谱等技术分离、鉴定与cPKCγ相互作用的蛋白;利用蛋白印迹技术分析HSP60蛋白表达量在脑HPC和缺血中的变化。结果: 与常氧组比较,HPC小鼠脑皮层膜相关成分中与cPKCγ相互作用的HSP60蛋白表达量升高,经免疫共沉淀证明cPKCγ与HSP60存在相互作用。在MCAO缺血模型中,与Norm+sham组小鼠相比,Norm+I组及HPC+I组小鼠皮层缺血核心区、半影区HSP60表达水平明显升高(P<0.05)。HPC+I组小鼠缺血核心区HSP60表达水平低于Norm+I组(P<0.05)。结论: 研究结果表明,cPKCγ-HSP60信号通路可能参与了低氧预适应的发生发展过程。     

Changes in cPKC isoform-specific membrane translocation and protein expression in the brain of hypoxic preconditioned mice

Previous studies have shown that the level of total conventional protein kinase C (cPKC) membrane translocation (activation) was increased in the brain of hypoxic preconditioned mice. In order to find out which isoform of cPKC may participate in the development of cerebral hypoxic preconditioning (HPC), we used Western bolt and immunohistochemistry to observe the effects of repetitive hypoxic exposure (H1-H6, n = 6 for each group) on the level of cPKC isoform-specific protein expression and its membrane translocation in the cortex and hippocampus of mice. We found that the levels of cPKC betaII and gamma membrane translocation were increased significantly (p < 0.05 versus normoxic H0 group, n = 6) in response to repetitive hypoxic exposure (H1-H4) at an early phase of hypoxic preconditioning, but no significant changes of cPKC alpha and betaI membrane translocation were found during cPKC alpha, betaI, betaII and gamma protein expression both in hippocampus and cortex. In addition, an extensive subcellular redistribution of cPKC betaII and gamma was detected by immunohistochemistry staining in the cortex after repetitive hypoxic exposures (H3). However, a significant decrease in the expression of cPKC gamma protein (p < 0.05 versus H0 group) was found only in the cortex of delayed hypoxic preconditioned mice (H5-H6). These results suggest that the activation of cPKC betaII and gamma may be involved in the early phase of cerebral hypoxic preconditioning and the changes in cPKC gamma protein expression may participate in the development of the late phase of cerebral hypoxic preconditioning as well as selective vulnerability to hypoxia both in cortex and hippocampus.     

Type I epithelial cells are the main target of whole-body hypoxic preconditioning in the lung

Whole-body hypoxic preconditioning (WHPC) prolongs survival of mice exposed to severe hypoxia by attenuating pulmonary edema and preserving gas exchange. However, the cellular and molecular mechanism(s) of this protection remains unclear. The objective of this study was to identify the cellular target(s) of WHPC in the lung. Conscious mice were exposed to hypoxia (7% O(2)) for 6 hours with or without pretreatment of WHPC ([8% O(2)] x 10 min/[21% O(2)] x 10 min; 6 cycles). Hypoxia caused severe lung injury, as shown by the development of high-permeability-type pulmonary edema and the release of lactate dehydrogenase and creatine kinase into the airspace and the circulation. All these signs of hypoxic lung injury were significantly attenuated by WHPC. Hypoxia also caused a remarkable release of type I cell markers (caveolin-2 and receptor for advanced glycation end products) in lung lavage that was almost completely abolished by WHPC. Conversely, hypoxia-induced release of type II cell markers (surfactant-associated proteins A and D) was only marginal, and was unaffected by WHPC. Electron microscopic analysis demonstrated considerable hypoxic damage in alveolar type I cells and vascular endothelial cells. Notably, WHPC completely eliminated hypoxic damage in the former and alleviated it in the latter. Type II cells appeared normal. Furthermore, WHPC up-regulated protein expression of cytoprotective genes in the lung, such as heat shock proteins and manganese superoxide dismutase. Thus, WHPC attenuates hypoxic lung injury through protection of cells constituting the respiratory membrane, especially hypoxia-vulnerable type I epithelial cells. This beneficial effect may involve up-regulation of cytoprotective genes.     

结缔组织生长因子在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞中的表达及意义

目的:动态观察结缔组织生长因子(CTGF)蛋白在血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞表达水平的时相变化,探讨其与肝窦内皮细胞下基底膜形成的关系。方法:采用腹部敷贴法建立血吸虫病肝纤维化模型,HE、Masson染色和透射电镜观察其病理变化;免疫组化技术检测CTGF、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和层粘连蛋白(LN)在小鼠肝脏组织中的表达和分布;并应用彩色图像分析仪进行定量分析。结果:与正常对照组比较,模型组鼠肝窦内皮细胞表达CTGF蛋白阳性或强阳性,肝窦壁LN、ColⅣ表达水平增高,且随着肝纤维化的发展,CTGF和LN、ColⅣ表达逐渐增强,肝窦内皮下基底膜逐渐增厚。图像定量分析两组平均吸光度值、平均灰度值和阳性面积比具有统计学差异;CTGF蛋白与LN、ColⅣ水平呈正相关。结论:血吸虫病肝纤维化时小鼠肝窦内皮细胞通过CTGF蛋白表达上调,调控细胞外基质产生,导致ColⅣ、LN分泌增加,参与肝窦内皮下基底膜形成,从而引起肝内微循环障碍。     

环氧乙烷对小鼠脊髓神经细胞膜上嵌入蛋白质分布的影响

目的：研究环氧乙烷对小鼠神经细胞膜上嵌入蛋白质分布的影响。方法：小鼠每天吸入环氧乙烷２h,持继２或３个月,用冰冻蚀刻电镜观察小鼠腰髓前角神经细胞膜上嵌入蛋白质的 分布。结果：随着染毒时间延长,腰髓前肴神经细胞膜上的嵌入蛋白质由分布紊乱至成簇聚集。结论：环氧乙烷能改变神经细胞膜上嵌入蛋白质的分布。     

Glycophorin A requirement for expression of O-linked antigens on the erythrocyte membrane

BACKGROUND: Glycophorin A (GPA) has a large number of sialic acid-containing oligosaccharide chains. GPA is highly conserved among vertebrates, mice with a GPA deletion have not been reported and GPA's physiologic role remains uncertain. RESULTS: GPA-/- homozygotes were obtained by intercrossing GPA+/- heterozygotes based on Mendelian genetics. The amount of O-linked oligosaccharide chains in the erythrocyte membrane of GPA-/- mice decreased to 60% compared to that of the wild-type mice. Flow cytometry and Western blot analysis revealed that the TER antigen that is associated with GPA on the erythrocyte membrane was totally abrogated from the cell surface in GPA-/- mice. Several glycoproteins that were detected with peanut agglutinin (PNA), a lectin that recognizes O-linked oligosaccharide chains, were absent from the GPA-/- erythrocyte membrane. Erythrocytes lacking GPA were more sensitive to hypo-osmotic stress than wild-type erythrocyte. CONCLUSIONS: GPA-/- mice show apparently normal phenotypes at least during the early generations. The disappearance of many glycoproteins recognized by PNA lectin on the GPA-/- erythrocyte membrane proteins suggests that GPA has an essential role in the expression of O-linked antigens on the erythrocyte membrane protein. These interactions of GPA and other glycoproteins may contribute to maintaining the physical strength of the erythrocyte membrane.     

化学预处理对低氧预适应模型小鼠的影响

背景：低氧诱导因子1α调节一些增加抗低氧耐受的基因的表达。氯化钴是一种能够稳定低氧诱导因子1α的化学试剂。 目的：检测氯化钴预处理对急性重复低氧小鼠的影响。 方法：Balb/C小鼠随机分为预处理组和对照组,实验前3 h,两组分别注射氯化钴和生理盐水后, 分别进行0次(正常对照组),1次,4次缺氧暴露,随即分别取海马组织进行指标检测。 结果与结论：预处理组缺氧暴露1次对低氧耐受时间显著高于对照组缺氧暴露1次,预处理组缺氧暴露1次,4次低氧耐受时间差异无显著性意义。对照组中缺氧暴露4次组低氧诱导因子1的DNA结合活力显著高于缺氧暴露1次组和正常对照组,组间比较差异有显著性意义。预处理组中缺氧暴露1次组低氧诱导因子1的DNA结合活力显著高于正常对照组(P < .01),缺氧暴露4次组低氧诱导因子1的DNA结合活力急剧下降,显著低于缺氧暴露1次组和正常对照组。对照组促红细胞生成素和血管内皮生长因子mRNA 在缺氧暴露1次组和缺氧暴露4次组升高,各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。预处理组促红细胞生成素和血管内皮生长因子mRNA表达组间比较差异无显著性意义。提示氯化钴预处理能够提高低氧耐受时间,降低低氧预适应诱导的耐受时间及低氧诱导因子1 DNA结合能力。