脂肪分化相关蛋白对软脂酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的:构建编码脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因全长序列的真核表达载体,探讨ADRP过表达对软脂酸诱导的H9 c2心肌细胞凋亡有何影响。方法:(1)采用PCR的方法,以成年SD大鼠心肌cDNA为模板扩增编码ADRP全长的DNA序列,重组入pEGFP-C1质粒表达载体中,酶切、测序鉴定后转化大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,扩增后提取质粒,进行酶切和测序鉴定;(2)采用脂质体转染法将鉴定后的重组质粒转染H9 c2心肌细胞株,经G418筛选获得抗性细胞克隆后扩大培养;荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白报告基因表达情况;RT-qPCR和Western blot检测转染细胞与正常细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平;(3)采用流式细胞术检测不同浓度软脂酸对上述细胞细胞凋亡率的影响。结果:(1)酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入表达质粒pEGFP-C1;(2)荧光显微镜观察细胞内有绿色荧光蛋白表达且传20代以上无消失;RT-qPCR和Western blot证明重组质粒转染H9 c2细胞ADRP mRNA和蛋白表达水平明显高于空质粒转染组和正常对照组(P<0.01);(3)经不同软脂酸刺激后,重组质粒转染H9 ...     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响

 目的： 探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法： 逆转录获得人WT1(17AA－/KTS－)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上, 酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V 检测细胞凋亡。结果： 成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA－/KTS－),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting 显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA－/KTS－) mRNA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组, 差异显著(P<0.05)。加2 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）培养48 h后, 形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态, 但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论： 增加外源性WT1(17AA－/KTS－)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3 诱导的细胞凋亡。     

重组Pegfp-C2-PSF质粒的构建及表达

目的 将人类PSF基因定向连人pEGFP-C2质粒,使PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究PSF蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法 采用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切方法,从pGEX-2TK-PSF质粒中获得PSF蛋白的cDNA全长;连入pEGFP-C2质粒的C端.将构建成功的pEGFP-C2-PSF质粒转染人HeLa 细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 ①将该质粒进行双酶切鉴定可见PSF片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论 ① PSF cDNA全长成功连入pEGFP-C2质粒;② PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

AMPKα2基因shRNA重组质粒的构建以及在氯离子介导的大鼠心肌缺氧/复氧损伤中的作用

 目的：构建AMP活化的蛋白激酶α2亚基(AMPKα2)基因shRNA重组表达质粒,转染H9c2心肌细胞,探讨其在氯离子(Cl^-)介导的心肌细胞缺氧/复氧（A/R）损伤中的作用。方法：构建靶向AMPKα2基因的shRNA重组质粒pSuper-AMPKα2 shRNA,转染H9c2细胞;Western blotting法测定AMPKα2的蛋白表达情况。实验分5组,每组重复6次：(1) Control组;(2) A/R组;(3) Cl^--free A/R组;(4) pSuper+Cl^--free A/R组;(5) pSuper-AMPKα2 shRNA+ Cl^--free A/R组。处理结束后,生化自动分析仪测定LDH活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：重组表达质粒pSuper-AMPKα2 shRNA经测序证明构建正确;转染心肌细胞后,AMPKα2蛋白表达明显下降;Cl^--free A/R组较之A/R组细胞存活率升高,LDH含量下降,细胞凋亡减少,ROS生成减少,SOD和GSH-Px活性增加;转染pSuper-AMPKα2 shRNA质粒后,阻断了Cl--free液的保护作用,且ROS生成增加,SOD和GSH-Px活性也下降。结论：成功构建pSuper-AMPKα2 shRNA重组质粒。AMPKα2基因沉默阻断了Cl^--free液对心肌细胞A/R损伤的保护作用。     

敲减G蛋白偶联受体75表达抑制20-HETE诱导的H9c2心肌细胞凋亡

目的:探讨G蛋白偶联受体75(GPR75)对20-羟二十烷四烯酸(20-HETE)诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响及机制。方法:慢病毒转染敲减H9c2心肌细胞GPR75基因表达;TUNEL法检测细胞凋亡率;RT-qPCR法检测GPR75以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的mRNA表达;JC-1荧光探针检测线粒体膜电位水平;Western blot法检测GPR75、Bcl-2、Bax及细胞色素C(CytC)蛋白表达;发色底物法检测caspase-3的活性。结果:H9c2心肌细胞在mRNA及蛋白水平均表达GPR75,敲减GPR75抑制了20-HETE诱导的细胞凋亡(P<0.05);同时,敲减GPR75阻断了20-HETE诱导的Bax和CytC表达上调以及caspase-3活性增高作用(P<0.05),逆转了20-HETE诱导的Bcl-2表达下调和线粒体膜电位下降(P<0.05)。结论:20-HETE通过GPR75介导引起线粒体功能紊乱,诱导H9c2心肌细胞凋亡。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

过表达连接子蛋白40(Cx40)通过引起细胞周期阻滞抑制H9c2大鼠心肌细胞增殖

目的 建立过表达连接子蛋白40(Cx40)的H9c2心肌细胞稳定株，初步探讨慢病毒载体介导的Cx40蛋白过表达对H9c2细胞增殖的影响及其相关机制。方法 采用实时定量PCR从H9c2细胞株扩增Cx40基因片段，与慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro连接，获得重组pLVX-Flag-Cx40表达载体。通过与包装质粒共转染人胚肾HEK293T细胞，获得携带Flag-Cx40的重组慢病毒颗粒。感染的H9c2细胞经嘌呤霉素(puromycin)筛选出稳定表达株(H9c2-Flag-Cx40细胞)。采用Western blot法检测Cx40蛋白表达情况；通过CCK-8法检测Cx40对H9c2细胞增殖的影响；流式细胞术检测细胞周期的变化；实时定量PCR检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的mRNA表达；Western blot法检测cyclin D1蛋白表达；免疫共沉淀(Co-IP)实验检测H9c2细胞Cx40和Yes相关蛋白(YAP)的相互结合情况；分离胞质、胞核蛋白，利用Western blot法检测Cx40对YAP细胞定位的影响。结果 测序结果显示成功构建重组pLVX-Flag-...     

靶向泛素连接酶SIAH2的shRNA对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响

 目的：探讨shRNA介导的泛素连接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)基因表达抑制对人肝癌细胞株HepG2细胞周期和凋亡的影响。方法：用已构建的pGenesil-SIAH2重组质粒转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。采用RT-PCR和Western blotting 技术检测重组质粒对SIAH2 mRNA和蛋白表达的影响,MTS比色法测定重组质粒转染对细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后细胞周期和凋亡的变化。结果：与对照组相比,pGenesil-SIAH2能显著抑制SIAH2 mRNA和蛋白的表达水平;pGenesil-SIAH2转染组细胞增殖速度明显减慢;pGenesil-SIAH2组细胞明显阻滞于G1期,细胞凋亡率明显升高。结论: pGenesil-SIAH2能有效抑制HepG2增殖,使细胞周期阻滞在G1期,并诱导其早期凋亡。上述研究为以SIAH2为靶点的肝癌基因治疗提供实验依据。     

NOD8对H2O2诱导的人肝细胞凋亡的影响

 目的:探讨NOD8对H2O2诱导的人肝细胞L02凋亡的影响。 方法: pEGFP-C2 及pEGFP-NOD8重组质粒经JetPRIME介导转染L02细胞;用H2O2诱导细胞凋亡。实验分为pEGFP-C2组、pEGFP-C2+H2O2组和pEGFP-NOD8+H2O2组。采用MTT法检测细胞活性,Western blotting检测细胞NOD8的蛋白表达,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测细胞caspase-3活性。 结果: 通过MTT检测不同浓度（0.2～2 mmol/L）H2O2刺激6 h后的细胞活性,确定1 mmol/L H2O2为诱导细胞凋亡的剂量。Western blotting检测结果显示,转染pEGFP-NOD8质粒的细胞NOD8蛋白表达明显增加。Hoechst 33342染色法观察发现,pEGFP-C2+H2O2组有较多细胞出现强蓝色荧光细胞核,细胞凋亡较多,而pEGFP-NOD8+H2O2组细胞凋亡明显减少。流式细胞术分析显示,pEGFP-C2+H2O2组的细胞凋亡率明显升高,pEGFP-NOD8+H2O2组的细胞凋亡率则显著下降。pEGFP-C2+H2O2组细胞的caspase-3活性明显升高,而pEGFP-NOD8+H2O2组细胞的caspase-3活性显著下降。 结论: NOD8可抑制H2O2诱导的L02细胞凋亡,其作用机制可能与NOD8抑制细胞的caspase-3活性有关。     

结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备

目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。     

VEGF_(165)真核表达载体的构建及其对白血病细胞增殖和化疗药物敏感性的影响

目的:构建血管内皮细胞生长因子的真核表达载体,探讨其对白血病细胞的增殖以及化疗药物敏感性的影响。方法:应用常规基因克隆方法构建pEGFP-C1-hVEGF165真核表达载体,转染白血病细胞K562,采用CCK8法检测重组质粒对细胞增殖的影响,RT-PCR方法检测细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达水平,ELISA方法定量检测细胞培养液和细胞内VEGF蛋白的表达水平,用流式细胞仪检测细胞周期。结果:经酶切鉴定和基因测序证实成功构建了VEGF165真核表达载体。稳定转染pEGFP-C1-hVEGF165的K562细胞较转染pEGFP-C1空质粒的K562细胞增殖加快,VEGF165 mRNA表达明显增加,细胞分泌VEGF蛋白水平上调。转染pEGFP-C1-hVEGF165还可以提高白血病细胞在化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶作用时的细胞存活率。结论:VEGF165真核表达载体可以上调白血病细胞K562的VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达水平,从而促进白血病细胞的增殖,同时可以降低白血病细胞对化疗药物高三尖杉酯碱和氟尿嘧啶的敏感性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

CCAAT增强子结合蛋白α对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在体内和体外对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响及其可能机制.方法 将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα经阳离子脂质体介导转染HL60细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株为转染组;以转染pEGFP空载质粒HL60细胞为空载体组;未处理的HL60细胞为对照组.瑞氏染色观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析凋亡;RT-PCR及免疫印迹法(Western blot)检测c-myc基因的表达.20只BALB/c裸鼠按完全随机法分为3组:转染组7只、空载体组7只、对照组6只.将3组细胞分别皮下注射相应各组小鼠形成皮下瘤,20 d后处死小鼠,测量肿瘤质量及大小,TUNEL法检测皮下瘤组织细胞凋亡率.结果 筛选到C/EBPα基因稳定表达的细胞株pEGFP-C/EBPα-HL60,细胞出现明显分化.对照组、空载体组和转染组细胞的凋亡率分别为(5.4±1.4)%、(5.0±1.3)%、(21.9±4.5)%,转染组细胞的凋亡率显著高于对照组和空载体组(均P＜0.05).RT-PCR及免疫印迹显示C/EBPα明显抑制c-myc mRNA和蛋白的表达(均P＜0.05).对照组、空载体组和转染组细胞接种小鼠形成皮下瘤,其质量分别为(5.35±1.12)g、(5.12±1.31)g和(3.26±0.72)g,瘤体大小分别为(25±4)mm、(18±3)mm和(11±2)mm,转染组瘤体质量及瘤体大小明显低于对照组和空载体组(均P＜0.05).与对照组和空载体组比较,转染组皮下瘤组织细胞凋亡率明显增加(均P＜0.05).结论 C/EBPα在HL60细胞中具有促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力,显示C/EBPα在急性粒细胞白血病中是一种肿瘤抑制因子.     

新型细胞因子IL-24真核表达载体的构建、表达及其对肿瘤的抑制作用

目的：构建IL-24真核表达质粒，并研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法：采用重组DNA技术构建IL-24真核表达质粒pEGFP-C1-IL-24。用脂质体法将重组质粒及空载体外转染HIC细胞，再经激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察其表达，用MTT法检测HIC细胞的体外增殖能力，用流式细胞仪检测细胞周期与凋亡。小鼠皮下接种转染IL-24真核表达质粒或空载的B16细胞观察其体内致瘤性的变化。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的生长抑制作用。结果：pEGF-C1-IL-24转染HIC细胞后，LSCM可观察到其表达。IL-24基因转染的HIC细胞体外增殖能力明显受到抑制．G2-M期细胞比例增高，细胞被阻滞在G2-M期。转染IL-24的B16细胞体外致瘤率降低。与对照组相比．IL-24基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制（P〈0.05）。结论：IL-24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。瘤内注射pEGFP-C1-IL-24可抑制肿瘤生长，具有明显的抗肿瘤作用。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化

目的 构建大鼠Lhx8全长结构基因真核表达载体。方法 PCR法扩增Lhx8全长结构基因,经EcoRI和BamHI双酶切后连接至真核表达载体pEGFP-C3中,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8经测序鉴定后,采用脂质体转染的方法转染至体外培养的海马神经干细胞中。 结果 测序鉴定表明,重组质粒pEGFP-C3- Lhx8-EGFP构建成功,该重组质粒转入体外培养的神经干细胞后,质粒转染组中ChAT阳性的细胞数较阴性对照组明显增多（P<0.05）。 结论 重组质粒pEGFP-C3- Lhx8-EGFP构建成功,Lhx8能够促进NSCs向ChAT阳性的细胞分化。